細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

宋 鴻，韓云竹，蔡國(guó)徽

(遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

細(xì)胞是高等生物有機(jī)體一切生命活動(dòng)的基本單位，個(gè)體發(fā)育過程中無數(shù)功能及形態(tài)各異的細(xì)胞形成了不同的組織和器官，這個(gè)復(fù)雜的過程不僅受遺傳物質(zhì)的調(diào)控，更離不開三維立體微環(huán)境中各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extra- cellular matrix，ECM)間相互粘附等多種信號(hào)的調(diào)節(jié)。體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是在體外維持細(xì)胞、組織及器官生存及生長(zhǎng)的一種技術(shù)。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)象，可采用不同的方法和技術(shù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞體外研究多采用單層細(xì)胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)裝置常為玻璃或塑料的二維平面。事實(shí)上，這種培養(yǎng)方法是無法模擬具有空間結(jié)構(gòu)的ECM與細(xì)胞之間的相互作用，許多細(xì)胞從組織中分離并進(jìn)行二維平面培養(yǎng)后，會(huì)逐漸平面化、異常分化并失去分化表型[1]。數(shù)十年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞外微環(huán)境中各種細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞之間及細(xì)胞與ECM相互粘附等多種信號(hào)積極參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡等生命活動(dòng)[2-4]。因此細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過不斷的改進(jìn)，經(jīng)歷了由二維到三維，由靜止三維培養(yǎng)到動(dòng)力三維培養(yǎng)的過程?，F(xiàn)將細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展、細(xì)胞培養(yǎng)支架材料以及細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行綜述。

1 二維細(xì)胞培養(yǎng)

1907年，Harrison用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)獲得成功，創(chuàng)立了最早的動(dòng)物細(xì)胞二維培養(yǎng)法，經(jīng)過不斷改進(jìn)，發(fā)展到現(xiàn)代的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿培養(yǎng)。由于二維培養(yǎng)方法具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易操作、費(fèi)用低、可大批量應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，因此已經(jīng)成為了體外細(xì)胞培養(yǎng)的主要方法。然而，這種培養(yǎng)方式存在著許多缺點(diǎn)：首先，在體內(nèi)組織細(xì)胞所處的局部微環(huán)境是三維立體的，它們的運(yùn)動(dòng)經(jīng)常受到局部化學(xué)信號(hào)或分子梯度的影響，分子梯度對(duì)于細(xì)胞的分化、組織器官的形成、信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)信號(hào)傳遞及許多生物代謝過程起著重要的作用，但是在常規(guī)的體外二維培養(yǎng)方法中幾乎是不可能建立這種的三維分子梯度的，因此二維培養(yǎng)不能夠?yàn)榻M織細(xì)胞提供正常生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境條件，而生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)及行為有著重要的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，從小鼠體內(nèi)得到的具有多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞[5]，在體外進(jìn)行二維培養(yǎng)后，其多藥耐藥性會(huì)消失，而在三維培養(yǎng)條件下，會(huì)恢復(fù)其多藥耐藥性[6]。由此可見以單層細(xì)胞為模型，研究腫瘤對(duì)放化療敏感性，所得到的結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)往往存在很大的差距[5,7]；其次，直接從機(jī)體中分離得到的原代細(xì)胞，在二維培養(yǎng)條件下它們的代謝及基因表達(dá)譜會(huì)發(fā)生不斷地變化。雖然在組織和器官中ECM蛋白和細(xì)胞受體之間的相互作用是普遍存在的現(xiàn)象，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定了細(xì)胞活性。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、ECM及基底膜經(jīng)蛋白與蛋白之間的相互作用影響著整個(gè)細(xì)胞的代謝過程。在二維培養(yǎng)中常需要調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度，以便于細(xì)胞適應(yīng)外在環(huán)境，這不僅僅改變了氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和ECM間的相互作用，也改變了細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的清除；此外，細(xì)胞在二維環(huán)境生長(zhǎng)過程中可使ECM蛋白和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，這可能是由于細(xì)胞表面的受體首先聚集在直接暴露于培養(yǎng)液的細(xì)胞局部所導(dǎo)致，然而實(shí)際上在機(jī)體內(nèi)粘附于細(xì)胞表面的受體是很少有機(jī)會(huì)聚集的，因此在二維培養(yǎng)條件下這種聚集現(xiàn)象可能導(dǎo)致細(xì)胞表面的受體位置偏離，從而影響了細(xì)胞間的相互作用；除此之外，在二維培養(yǎng)中，細(xì)胞附在底物平面上生長(zhǎng)，因缺少立體支架，只能向二維發(fā)展，細(xì)胞失去原有的立體形態(tài)。因此，二維培養(yǎng)所反映的生物學(xué)性狀，與體內(nèi)組織細(xì)胞相差甚遠(yuǎn)。通常的結(jié)果是細(xì)胞發(fā)生去分化現(xiàn)象，培養(yǎng)的細(xì)胞不僅失去了正常的形態(tài)，而且失去了其生化與功能特性，如軟骨細(xì)胞在單層培養(yǎng)過程中，呈現(xiàn)出類似成纖維細(xì)胞的去分化形態(tài)，并且由正常條件下的分泌Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)變到分泌Ⅰ型膠原[8]，這一形態(tài)與功能變化與培養(yǎng)條件有關(guān)。可見體外組織細(xì)胞的培養(yǎng)受到眾多因素的影響，二維培養(yǎng)已不能滿足組織細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的局部微環(huán)境。

2 三維細(xì)胞培養(yǎng)及其支架材料

隨著對(duì)細(xì)胞所處微環(huán)境的了解，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)歷了從二維到三維的發(fā)展過程。三維培養(yǎng)就是利用各種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方式生長(zhǎng)。這種生長(zhǎng)方式更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)模式，形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能，因此三維培養(yǎng)體系為細(xì)胞提供了類似體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的支架或基質(zhì)，同時(shí)細(xì)胞通過緊密連接和縫隙連接等方式建立了細(xì)胞間及細(xì)胞與ECM間的聯(lián)系，形成了一定的三維結(jié)構(gòu)。

East等[9]使用三維培養(yǎng)系統(tǒng)記錄了不同腫瘤通過正常組織每天的移動(dòng)速率后，推進(jìn)了細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞三維培養(yǎng)受到眾多因素的影響，如種子細(xì)胞、生物支架材料、生長(zhǎng)因子、力學(xué)環(huán)境等[10]，其中生物支架材料的影響尤為重要。在過去的20年中，一些生物聚合材料如PLLA、PLGA、PLLA-PLGA共聚物，及生物材料如藻酸鹽、瓊脂糖、膠原等[11-14]已經(jīng)被廣泛用于體外細(xì)胞三維培養(yǎng)中，這些培養(yǎng)體系最突破性進(jìn)展強(qiáng)調(diào)了生物材料模擬自然發(fā)生的三維細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與生物材料支架之間的相互作用，可以說細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)促進(jìn)了組織工程學(xué)的發(fā)展，為其開創(chuàng)了一個(gè)新領(lǐng)域[15]。

合成聚合物或共混聚合物材料的目的就是建立體外細(xì)胞三維培養(yǎng)，然而這些聚合物生物材料的微纖維直徑一般為10～50 μm，與大部分細(xì)胞的直徑(5～30 μm)相近，這使得吸附在微纖維上的細(xì)胞處于二維弧形環(huán)境里，實(shí)際上細(xì)胞仍處于一種二維培養(yǎng)環(huán)境中。此外，這些聚合物生物材料所形成支架網(wǎng)孔直徑一般為10～200 mm，這比一般的生物分子大了1000～10 000倍，結(jié)果導(dǎo)致生物分子快速擴(kuò)散，因此對(duì)于一個(gè)真正而言的三維環(huán)境，構(gòu)成支架的纖維及所形成的網(wǎng)孔直徑一定比培養(yǎng)細(xì)胞小的多，這樣細(xì)胞被支架纖維所包繞，這就好比模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞處于一種ECM環(huán)境中[16]。

此外，一些來源于動(dòng)物的生物材料如膠原蛋白、粘多糖及Matrigel等用于細(xì)胞三維培養(yǎng)中[17-19]，但是對(duì)于所有動(dòng)物來源的材料來說，一個(gè)潛在的問題就是它們可能攜帶危險(xiǎn)的病原菌[20]，如朊病毒是最令人擔(dān)心的病原菌，或經(jīng)常會(huì)帶有一些殘留的生長(zhǎng)因子及一些成分不清或數(shù)量不確定的混雜物，這將導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量比較難控制。這些問題不僅給實(shí)驗(yàn)研究帶來了困難，也為組織工程用于人體疾病的治療帶來了巨大的麻煩。因此，理想的三維培養(yǎng)體系必須明確細(xì)胞支架合成生物材料的組分，就這而言，分子自組裝肽支架有可能被選擇用作細(xì)胞三維培養(yǎng)支架。分子自組裝肽支架因成分純凈、性能穩(wěn)定、無免疫原性且降解產(chǎn)物無毒、具有較好的生物相容性及可調(diào)控的生物降解性[21]，被視為理想的細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。已有研究表明，自組裝短肽RADA16具有良好的結(jié)構(gòu)與性能，能提供類似ECM結(jié)構(gòu)的微環(huán)境，較好的進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞等的體外三維培養(yǎng)[21-22]。

3 細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素

3.1 細(xì)胞粘附與相關(guān)結(jié)構(gòu) 腫瘤侵襲過程中，腫瘤細(xì)胞必須先與ECM發(fā)生接觸，隨后酶解并穿過ECM，而與ECM及其鄰近細(xì)胞的粘附?jīng)Q定了腫瘤細(xì)胞的形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)特性。此外，為了調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、分化、增殖及遷移等細(xì)胞行為，細(xì)胞需要綜合粘附的成分、結(jié)構(gòu)、數(shù)量等多種信號(hào)[23]。故體外研究細(xì)胞的生物學(xué)行為需將細(xì)胞從原生細(xì)胞間及細(xì)胞與ECM的相互作用中剝離，再引入設(shè)定的二維或三維培養(yǎng)新環(huán)境中。

二維與三維細(xì)胞體外培養(yǎng)最顯著的區(qū)別在于細(xì)胞形貌的差異。當(dāng)細(xì)胞在二維平面生長(zhǎng)時(shí)，很容易在水平表面粘附、遷移，但無法在空間層面擴(kuò)展。原因之一是細(xì)胞生長(zhǎng)在二維平面時(shí)存在頂?shù)讟O性，這種極性與某些類型的細(xì)胞有關(guān)，如上皮細(xì)胞，但大多數(shù)間充質(zhì)細(xì)胞卻出現(xiàn)異?！?dāng)在三維基質(zhì)中再培養(yǎng)，則表現(xiàn)為星形且遷移期間只從前到后發(fā)生極化[24]，而這種細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)及構(gòu)成的變化可直接影響細(xì)胞的功能[25]。有研究表明，細(xì)胞的扁平化可有效增加表面體積(即細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì))比，從而有利于信號(hào)物質(zhì)從細(xì)胞表面進(jìn)入內(nèi)部[26]。通過在二維平面中設(shè)置“微型粘附島”，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞伸展程度的變化會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及分化等產(chǎn)生影響[27]。除了伸展的總面積，細(xì)胞的幾何形狀也會(huì)改變細(xì)胞的功能[28]。雖然二維培養(yǎng)中細(xì)胞的形貌和伸展面積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變，但三維培養(yǎng)中這些因素是否對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響尚未明確[29]。事實(shí)上，三維基質(zhì)中細(xì)胞的伸展或擴(kuò)散很可能與二維平面上發(fā)生的過程有很大不同。

結(jié)合細(xì)胞外環(huán)境的結(jié)構(gòu)多樣性，不難想到三維環(huán)境中的粘附過程是高度可變的。二維培養(yǎng)中整合素介導(dǎo)的粘附過程包括：板狀偽足伸展，肌球蛋白相關(guān)細(xì)胞骨架張開，粘著斑強(qiáng)化[30]。整個(gè)過程只需很短的時(shí)間。然而在三維環(huán)境中，細(xì)胞必須通過跨越或酶解ECM才能得到伸展，這需要數(shù)小時(shí)、甚至幾天的時(shí)間方能實(shí)現(xiàn)，而非數(shù)分鐘[31]。Doyle等[32]重現(xiàn)了生物來源基質(zhì)上的三維粘附過程，發(fā)現(xiàn)二維和三維微環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞表面整合素類型有很大不同。有趣的是， Eyckmans等[33]發(fā)現(xiàn)，這種三維粘附過程可通過在具有細(xì)條形微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的二維平面進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而重現(xiàn)。

目前，對(duì)ECM粘附配體空間分布的研究仍處于起步階段，利用二維技術(shù)研發(fā)出類似方法，可有效推動(dòng)三維狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞粘附的研究[34]。Levental 等[35]發(fā)現(xiàn)，位于細(xì)胞底部的ECM中粘附配體的分布會(huì)影響細(xì)胞的平面極性及有絲分裂紡錘體的產(chǎn)生。不僅如此，研究表明ECM的納米結(jié)構(gòu)對(duì)粘附的結(jié)構(gòu)、功能，甚至組成成分都有影響[36]?？紤]到疾病進(jìn)展過程中各種天然納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)結(jié)構(gòu)體系的研究就顯得尤為重要[37]。

3.2 力學(xué)傳導(dǎo) 普遍認(rèn)為，力學(xué)傳導(dǎo)在細(xì)胞間及細(xì)胞周圍廣泛存在，這些應(yīng)力在控制細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能上發(fā)揮了重要的作用[38-39]。早期有研究分別將細(xì)胞置于貼壁水凝膠(固定的)中及分離的可收縮凝膠(浮動(dòng)的)中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了ECM對(duì)細(xì)胞的力學(xué)作用，如乳腺上皮細(xì)胞腺泡和小管只形成于浮動(dòng)的凝膠中[40]，提示三維培養(yǎng)可能會(huì)影響機(jī)械應(yīng)力及其在細(xì)胞中的傳導(dǎo)通路。

傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)在玻璃或塑料等材料上進(jìn)行，細(xì)胞置于一種超生理硬度的靜態(tài)力學(xué)環(huán)境中。在意識(shí)到人工培養(yǎng)環(huán)境和組織微環(huán)境之間巨大的差異后，研究者利用柔軟的凝膠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ECM的機(jī)械硬度對(duì)細(xì)胞粘附、形態(tài)、以及干細(xì)胞分化及維持有一定影響[41]。柔軟的結(jié)構(gòu)特性并不是三維培養(yǎng)環(huán)境的固有特性，但卻是三維培養(yǎng)體系的一種共有特點(diǎn)，因此在研究二維與三維培養(yǎng)中細(xì)胞行為的差異時(shí)，應(yīng)將這個(gè)因素考慮在內(nèi)。細(xì)胞感應(yīng)機(jī)械硬度的具體機(jī)制仍不清楚，但目前大部分研究這種機(jī)制的方法均基于二維培養(yǎng)，而細(xì)胞在二維平面中感應(yīng)硬度的機(jī)制與在三維微環(huán)境中不盡相同。Huebsch等[42]通過證實(shí)三維RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)海藻酸凝膠中間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的分化，驗(yàn)證了凝膠硬度對(duì)細(xì)胞行為會(huì)產(chǎn)生一定的影響作用，并且MSC的分化表現(xiàn)出雙重效應(yīng)，在凝膠達(dá)到一個(gè)中界硬度時(shí)骨生成發(fā)生最大化，而在二維環(huán)境中達(dá)到穩(wěn)定水平。利用FRET成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞-ECM的相互關(guān)系，研究者同樣發(fā)現(xiàn)，三維基質(zhì)材料中骨發(fā)生需要細(xì)胞通過牽引力聚集整合素，且這種聚集在過硬的三維基質(zhì)中會(huì)停止，而在二維介質(zhì)中尚未發(fā)現(xiàn)[42]。

除了被動(dòng)傳感ECM的柔韌度等信號(hào)，細(xì)胞通常主動(dòng)負(fù)載一些諸如力學(xué)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)換的信息[38]。盡管目前尚不清楚外來應(yīng)力和內(nèi)生力是否通過常見的機(jī)械傳導(dǎo)通路被細(xì)胞感知[43]，但在二維和三維基質(zhì)中細(xì)胞感應(yīng)作用力的機(jī)制明顯不同。二維培養(yǎng)中研究細(xì)胞的拉伸變形是在光滑和均勻的平面進(jìn)行，細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化是可預(yù)見的。相比之下，大部分三維基質(zhì)是纖維性的，因而結(jié)構(gòu)具有非均質(zhì)性、各向異性[44]。作用力以何種形式傳遞給細(xì)胞取決于與細(xì)胞接觸的基質(zhì)纖維的比例和構(gòu)成，以及細(xì)胞是否直接固定和或受到材料的限制。例如，位于纖維軟骨內(nèi)的鄰近細(xì)胞，與膠原纖維的遠(yuǎn)近及粘連情況的差異也會(huì)導(dǎo)致伸展的程度不盡相同[45]。

3.3 效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)運(yùn) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氣體分子(如氧氣、二氧化碳)及可溶性分子(如生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子)等眾多的效應(yīng)分子對(duì)一些基本的細(xì)胞行為，如遷移、定位、血管生成及組織結(jié)構(gòu)整合等至關(guān)重要[46-48]，但在組織中這些分子的空間分布較為復(fù)雜，常由ECM的結(jié)構(gòu)及孔隙率、有無血管或細(xì)胞的分布等多方面因素共同參與調(diào)節(jié)。

在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模式中，由細(xì)胞分泌的或外在添加的可溶性因子通過充分混合、自由擴(kuò)散便可快速均衡分布。因此可在二維培養(yǎng)體系中研究一些短暫動(dòng)態(tài)的細(xì)胞行為變化，但觀察長(zhǎng)期的、與形態(tài)變化相關(guān)的過程，則需要該培養(yǎng)體系中與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的效應(yīng)分子能維持?jǐn)?shù)小時(shí)甚至數(shù)天的時(shí)間。不管是通過建立三維培養(yǎng)體系，還是僅在二維培養(yǎng)平面上覆蓋三維基質(zhì)模擬出ECM結(jié)構(gòu)，都會(huì)減慢體系中可溶性分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡過程，并且維持這種梯度分布的穩(wěn)定，如無ECM的球狀細(xì)胞團(tuán)就是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的三維模型，可捕捉一定半徑內(nèi)生物因子的分布梯度，而位于腫瘤細(xì)胞團(tuán)中的缺氧壞死區(qū)域，被證實(shí)有利于研究氧在腫瘤形成及耐藥中的作用[49]。

當(dāng)細(xì)胞置身于三維微環(huán)境中，基質(zhì)或支架的結(jié)構(gòu)特性如孔徑、纖維連接等均可調(diào)節(jié)可溶性因子的擴(kuò)散[50]。通過觀察μm級(jí)和mm級(jí)凝膠中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)MDCK細(xì)胞的作用差異，研究者發(fā)現(xiàn)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)間及層面與HGF的擴(kuò)散率密切相關(guān)，而與HGF所處的空間狀態(tài)無關(guān)[50]。盡管體外三維培養(yǎng)經(jīng)常忽略生物分子的擴(kuò)散對(duì)細(xì)胞行為的影響，但可溶性效應(yīng)因子擴(kuò)散的差異有時(shí)也會(huì)引起一些意想不到的細(xì)胞行為發(fā)生。Nelson等[51]發(fā)現(xiàn)了一種具有抑制作用的形態(tài)因子，能夠以自分泌的方式對(duì)三維μm級(jí)表皮組織中血管的出芽進(jìn)行精確定位。此外，利用三維組織中氧氣的分布，可準(zhǔn)確的對(duì)細(xì)胞代謝活躍區(qū)、缺氧區(qū)甚至死亡區(qū)域進(jìn)行定位[52]。

效應(yīng)分子的空間分布除了受擴(kuò)散因素的影響外，壓力的分布梯度和大規(guī)模組織變形也可影響細(xì)胞間質(zhì)的流體流動(dòng)及對(duì)流運(yùn)輸。實(shí)際上，作用力之間的耦合和溶質(zhì)的運(yùn)輸可能是三維環(huán)境下力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞信號(hào)的另外一種重要手段[53]。除此之外，ECM還能有效隔絕可溶性因子。研究證明，硫酸肝素蛋白聚糖可與ECM中的生長(zhǎng)因子活躍地結(jié)合，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β也與IV型膠原的存在有著密切關(guān)系[54]。ECM中各種生物因子在時(shí)間及空間水平的儲(chǔ)存與釋放很可能是控制細(xì)胞行為的重要機(jī)制。這些因子會(huì)通過一系列機(jī)制如蛋白水解酶降解基質(zhì)[55]，細(xì)胞的機(jī)械牽引等主動(dòng)釋放[56]，這也提示調(diào)節(jié)相關(guān)生物因子的釋放至少有兩條以上的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

4 展望

隨著藥物篩選和器官模型的研發(fā)，以及組織工程、再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在更接近體內(nèi)生理狀態(tài)的三維培養(yǎng)模型中驗(yàn)證二維培養(yǎng)體系的研究結(jié)果，將推動(dòng)細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。忽略空間的非特異性差異，深入研究培養(yǎng)微環(huán)境的內(nèi)在作用機(jī)制，才是揭示預(yù)期結(jié)果的關(guān)鍵途徑。未來主要研究的主題在于：細(xì)胞粘附的結(jié)構(gòu)、成分及其三維分布如何改變細(xì)胞形貌、骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及相應(yīng)的細(xì)胞功能；三維ECM中的力學(xué)傳導(dǎo)如何與平面培養(yǎng)物或柔軟的凝膠支架發(fā)生相互作用；支架或基質(zhì)材料的化學(xué)及物理結(jié)構(gòu)如何改變細(xì)胞生長(zhǎng)所需各種物質(zhì)的運(yùn)輸及利用率等。

為模擬細(xì)胞粘附、力學(xué)及化學(xué)因素對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，三維培養(yǎng)過程中還會(huì)有更復(fù)雜的現(xiàn)象發(fā)生，而細(xì)胞對(duì)此的自然反應(yīng)是結(jié)構(gòu)的改變。形態(tài)變化、組織重塑和細(xì)胞遷移等行為也會(huì)改變?nèi)S組織微環(huán)境，二維培養(yǎng)系統(tǒng)中卻難以重現(xiàn)這些過程。即便是簡(jiǎn)單的細(xì)胞行為，二維和三維狀態(tài)下也有顯著的差異。例如，二維基質(zhì)中的細(xì)胞遷移通過幾個(gè)迭代過程：前端擴(kuò)展、粘連形成、發(fā)生牽引和隨后尾緣的收縮。相比于這些既定的過程，細(xì)胞在三維環(huán)境中的遷移方式取決于基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、成分及力學(xué)特性等[44]。因此，研究細(xì)胞遷移等過程的模型仍在不斷探索中。

總之，體外細(xì)胞培養(yǎng)模型和天然組織環(huán)境之間不僅僅是二維平面與三維空間的差異。研究微環(huán)境中細(xì)胞粘附、力學(xué)傳導(dǎo)及效應(yīng)分子的作用機(jī)制，并明確它們?cè)诙S、三維培養(yǎng)時(shí)與體內(nèi)相比在調(diào)節(jié)機(jī)制上的異同最為重要。這不僅有助于研究者更好地將微環(huán)境培養(yǎng)組織工程化，從而更準(zhǔn)確地捕捉到細(xì)胞在體內(nèi)生存的真實(shí)場(chǎng)景，也有助于進(jìn)一步充分利用細(xì)胞功能。然而，忽略ECM是起源于細(xì)胞，只討論細(xì)胞微環(huán)境及其對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控是不科學(xué)的，不管是二維還是三維培養(yǎng)都只是在初始條件下進(jìn)行調(diào)控，還應(yīng)該考慮細(xì)胞和ECM的雙重關(guān)系和作用。

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