高效液相色譜法（HPLC）測定飼料中AC4的含量

■肖文龍 張可煜 吳 昊 王昊欣 薛飛群 張麗芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評價與殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/動物藥學(xué)研究室，上海 200241）

球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的重大原蟲病，多年來藥物是球蟲的防治主要依賴于三嗪類、磺胺類等抗球蟲藥物。然而，當(dāng)前臨床上球蟲耐藥性普遍，防治效果越來越低下，亟需安全、高效、無交叉耐藥的新型抗球蟲藥物以應(yīng)對這一局面。AC4是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所設(shè)計合成的新型結(jié)構(gòu)三嗪類化合物。已有的研究結(jié)果顯示，該藥不僅具有良好的抗球蟲效果，抗球蟲指數(shù)（ACI）達(dá)185～200，與地克珠利、妥曲珠利等其它三嗪類化合物無交叉耐藥性，而且無致畸、致癌、致突變作用，有望成為新型的抗球蟲藥物。

飼料添加是抗球蟲藥物普遍使用的一種給藥方式，同時在30、90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)等一般毒理學(xué)研究也常采用混飼的給藥方法。然而，目前飼料中AC4的檢測方法仍未建立，這使得AC4飼料預(yù)混劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究以及如何確保毒理學(xué)研究中飼料添加AC4的含量穩(wěn)定，質(zhì)量可靠受到挑戰(zhàn)。因此，本研究采用高效液相色譜方法建立起AC4在飼料中的含量檢測，以為飼料樣品中AC4質(zhì)量的控制提供方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters 2690高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters 2487檢測器（美國Waters公司）；氮吹儀(美國organomation Associates公司)；離心機(jī)(AnkeLXJ-ⅡB，上海安亭科學(xué)儀器廠)；渦旋混合器（XW-OA，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；AE240雙量程分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超純水系統(tǒng)（上海瑞楓生物科技有限公司）；

1.2 藥品和試劑

AC4對照品（含量≥99.8%，由上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)研究室制備）；乙酸乙酯，石油醚，正己烷，N，N-二甲基亞砜，磷酸，甲醇等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇為色譜純，其他均為分析純。所用水均為超純水。

1.3 溶液的配制

稱取0.500 g AC4標(biāo)準(zhǔn)品置于25 ml容量瓶中，用N，N-二甲基亞砜溶解配成20 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后取適量用N，N-二甲基亞砜分別稀釋成15 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml系列濃度溶液，于常溫保存。

1.4 樣品的前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取2.00 g飼料于50 ml具塞離心管中，加入20 ml乙酸乙酯，渦動1 min，300 r/min振蕩30 min，超聲15 min，4 000 r/min離心10 min，取10 ml上清置于另一離心管中，加入10 ml石油醚渦動混勻，4 000 r/min離心10 min。取混合液10 ml，于40℃水浴下氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.4.2 樣品的凈化

向吹干的殘渣中加入6 ml甲醇渦動1 min，超聲10 min，然后依次加入4 ml超純水，10 ml正己烷，4 000 r/min離心10 min，棄掉上層正己烷層及中層油脂層，下層留2 ml左右液體過0.22 μm微孔濾膜上HPLC測定。

1.5 色譜條件的確定及方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 色譜條件的確定

以甲醇和0.2%磷酸水溶液為流動相，通過高效液相色譜儀進(jìn)行樣品的分離，通過改變流動相的比例達(dá)到分離各峰的目的。

1.5.2 方法特異性

取AC4標(biāo)準(zhǔn)品溶液，空白飼料，空白飼料加標(biāo)樣品分別按1.4節(jié)處理，在上述HPLC條件下進(jìn)行測定，記錄色譜圖。

1.5.3 定量限和檢測限的確定

取 100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別稀釋成 10、7.5、2.5、2 μg/ml系列濃度溶液，分別取400 μl加到空白飼料中，按照1.4節(jié)樣品提取和純化方法進(jìn)行前處理，并在已經(jīng)確定的HPLC條件下進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以檢出的目標(biāo)峰峰高為10倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的定量限濃度，以檢出的目標(biāo)峰峰高為3倍基線噪音值時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的檢測限濃度。

1.5.4 線性關(guān)系

分別取 15 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml AC4系列濃度溶液400 μl分別加于2.00 g空白飼料中，按照1.4節(jié)樣品提取和純化方法進(jìn)行前處理，在已確定的色譜條件下進(jìn)樣并進(jìn)行HPLC分析，每個濃度點(diǎn)做5個平行，根據(jù)色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，確定回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.5.5 精密度測定

向2.00 g空白飼料中分別添加100 μg/ml、5 mg/ml和20 mg/ml AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液各400 μl，使AC4在飼料中的濃度分別為低、中、高3個添加濃度，即20 mg/kg、1 000 mg/kg和4 000 mg/kg，按照1.4節(jié)樣品提取和純化方法進(jìn)行前處理，并在已經(jīng)確定的HPLC條件下進(jìn)行測定，每個濃度做5個平行，計算AC4的日內(nèi)變異系數(shù)。此外，采用相同的方法連續(xù)3日每日重復(fù)1次，共3次，計算AC4的日間變異系數(shù)。

1.5.6 回收率

向2.00 g空白飼料中分別添加100 μg/ml、5 mg/ml和20 mg/ml AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液各400 μl使AC4在飼料中的濃度分別為低、中和高3個添加濃度，即20 mg/kg、1 000 mg/kg和4 000 mg/kg，按照1.4節(jié)樣品提取和純化方法進(jìn)行前處理，并在已經(jīng)確定的HPLC條件下進(jìn)行測定，每個濃度做5個平行，計算AC4在飼料中的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中AC4含量的HPLC檢測條件（見圖1）

圖1 飼料中AC4含量檢測的HPLC色譜

由圖1可知：分析柱為C18，粒徑5 μm,流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（體積比為65∶35），流速1.0 ml/min，檢測波長為251 nm，進(jìn)樣量為10 μl，柱溫為30℃的條件下，可以實(shí)現(xiàn)飼料中AC4的良好分離。

2.2 飼料中AC4含量HPLC檢測方法的驗(yàn)證

靈敏度：由試驗(yàn)結(jié)果可知，AC4在飼料中的定量限為1.5 mg/kg，檢測限為0.02 μg/ml。

線性關(guān)系：以AC4標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，AC4在20～4 000 mg/kg的添加濃度范圍內(nèi)，具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.999），回歸曲線和方程見圖2。

添加回收率及精密度（見表1）：從各添加濃度范圍內(nèi)的回收率結(jié)果可以看出，AC4的平均加標(biāo)回收率為98.4%～106.4%，日內(nèi)變異系數(shù)為0.7%～4.6%，日間變異系數(shù)為3.6%～4.3%。證明本實(shí)驗(yàn)建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度及精密度，符合測定要求。

圖2 AC4在飼料中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 飼料中AC4的回收率和精密度的檢測結(jié)果(n=5)

2.3 實(shí)際樣品測定

按上述方法測定含待測藥物AC4 100 mg/kg和2 500 mg/kg的高壓鼠料各3份。檢測結(jié)果表明，含量100 mg/kg藥物的飼料中AC4回收率分別為78.9%，76.3%和84.7%，平均回收率為80.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%；含量2 500 mg/kg藥物的飼料中AC4的回收率分別為83.4%，83.3%和84.6%，平均回收率為83.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%。

3 討論

3.1 儀器條件的選擇

本研究根據(jù)AC4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用C18反相色譜柱，紫外檢測波長251 nm，用甲醇、已腈、水、緩沖鹽等采用不同比例作流動相考察AC4與飼料中其他組分的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用乙腈-水系統(tǒng)AC4出峰時間較晚，甲醇-水系統(tǒng)出現(xiàn)主峰拖尾及出峰較晚的現(xiàn)象，采用甲醇-水-磷酸體系能實(shí)現(xiàn)主成分和各雜質(zhì)的良好分離。然后根據(jù)不同比例流動相的比較、優(yōu)化確定流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（65/35）。該流動相條件下峰形對稱，分離效果好，可用于飼料中AC4的含量測定。

3.2 樣品的提取

AC4在水中幾乎不溶解，在乙腈、氯仿、乙酸乙酯中微溶，在甲醇中略溶。由于氯仿是低毒物質(zhì)，且密度大，離心位于離心管下部，影響操作的準(zhǔn)確性。故本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈提取的物質(zhì)雜質(zhì)最少，但回收率較低；甲醇的回收率最高，但是甲醇提取的雜質(zhì)也較多；所以提取溶液選擇了乙酸乙酯，乙酸乙酯的提取回收率可以達(dá)到檢測要求的同時提取的雜質(zhì)峰的干擾較甲醇的少。有研究表明[4]，在提取過程中加入PBS緩沖液對飼料進(jìn)行潤濕可以提高藥物回收率，本試驗(yàn)在前處理方法摸索時對此進(jìn)行了考查，結(jié)果表明在主成分AC4回收率提高的同時，雜質(zhì)的回收率也同樣提高，而且雜質(zhì)的提高幅度大于主成分，考慮到不加PBS也能達(dá)到檢測的要求，遂放棄加入PBS緩沖液。

3.3 樣品的凈化

本研究采用液液萃取的方法，用正己烷和石油醚萃取油脂凈化。本研究先采用石油醚進(jìn)行萃取凈化，然后把溶液氮吹吹干，加入流動相比例溶液復(fù)溶，再在復(fù)溶的溶液中加入正己烷進(jìn)一步的萃取凈化，由于正己烷位于上層，中間為油脂層，故棄掉正己烷層及油脂層很容易操作，因?yàn)榧尤?0 ml流動相復(fù)溶，只要留下2 ml左右溶液過濾進(jìn)樣，這樣就不會出現(xiàn)抽取樣品不全導(dǎo)致的誤差，而且整個步驟簡單易行。

3.4 實(shí)際樣品檢測

從實(shí)際檢測樣品的結(jié)果可以看出，飼料中兩個添加水平的藥物平均回收率在80%左右，可能原因是飼料在加工過程中出現(xiàn)了損耗；但是從相對標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出，飼料混合均勻，此方法穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論

本文首次建立了高效液相色譜法測定飼料中AC4含量的方法，該方法操作簡單，重現(xiàn)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。為飼料中AC4質(zhì)量控制提供了有力的支持。