β-甘露聚糖酶對(duì)豆粕、棉粕和菜粕的體外酶解效果研究

■田軍輝 袁 林 喬家運(yùn) 王志祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381）

β-甘露聚糖是非淀粉多糖（NSP）的一種，在植物性飼料原料中含量很高，如小麥、玉米、豆粕、菜粕以及麩皮中的β-甘露聚糖分別占非淀粉多糖含量的11.9%、11.7%、22.7%、19.6%和33.7%[1]。β-甘露聚糖被動(dòng)物采食后，不易消化和吸收，具有較強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，對(duì)畜禽具有多種負(fù)面生理影響。目前認(rèn)為降解β-甘露聚糖較為可行的方法是加入相應(yīng)的酶制劑，能有效降低其抗?fàn)I養(yǎng)作用。研究表明，日糧中添加β-甘露聚糖酶能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[2]，提高飼料轉(zhuǎn)化效率，提高養(yǎng)分消化率，改善腸道微生態(tài)，降低消化道食糜黏度，提高微量元素利用率等作用[3]。采用動(dòng)物試驗(yàn)是評(píng)價(jià)β-甘露聚糖酶作用效果的主要方法，而有關(guān)其對(duì)豆粕、棉粕及菜粕的體外酶解效果研究尚不多見(jiàn)。因此，本文旨在通過(guò)體外消化試驗(yàn)來(lái)研究β-甘露聚糖酶對(duì)豆粕、棉粕和菜粕的酶解效果，為β-甘露聚糖酶合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的豆粕、棉粕和菜粕分別由河南牧鶴飼料有限公司、鄭州廣安飼料科技有限公司和河南億萬(wàn)中原生物技術(shù)有限公司提供。β-甘露聚糖酶由上海歐耐施生物技術(shù)有限公司提供，酶活≥50 000 U/g。酶活單位定義為：在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為3 mg/ml的甘露聚糖溶液中降解釋放1 μg還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

胃蛋白酶液（3 mg/ml）：稱取胃蛋白酶0.6 g，酶活800～2 500 U/g，加入200 ml生理鹽水溶解。胰酶液（15 mg/ml）：稱取胰酶3.0 g，1∶10 000，加入200 ml生理鹽水溶解。磷酸緩沖溶液（pH值7.0）：分別稱取NaH2PO4及Na2HPO448.69、174.80 g，加入4 000 ml蒸餾水水溶解。鹽酸溶液（1∶3）：準(zhǔn)確移取36%的鹽酸10 ml，加入到30 ml蒸餾水中混勻。氫氧化鉀溶液（7.5 mol/l）：稱取KOH 420 g，定容到1 000 ml。阿洛酮糖（內(nèi)標(biāo)物），標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司生產(chǎn)，色譜純）。

1.2 試驗(yàn)主要儀器及條件

氣相色譜儀為島津GC-2014C，毛細(xì)色譜柱為RTX-225。色譜條件：載氣N2，壓力為50 kPa；燃?xì)釮2，壓力為40 kPa；助燃?xì)飧呒兛諝猓瑝毫?0 kPa。FID檢測(cè)器溫度280℃，氣化室溫度220℃，所有樣品進(jìn)樣量均為2 μl，色譜柱流量為1.32 ml/min，分流比為18.0。

1.3 體外消化試驗(yàn)

分別以豆粕、棉粕、菜粕為底物，設(shè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5個(gè)組，β-甘露聚糖酶添加水平分別為0、0.4%、0.8%、1.6%和2.4%，每個(gè)水平設(shè)4個(gè)重復(fù)，模擬斷奶仔豬消化道環(huán)境進(jìn)行體外消化試驗(yàn)。用氣相色譜儀測(cè)定酶解后可溶性單糖含量，篩選出β-甘露聚糖酶適宜添加水平。

將豆粕、棉粕、菜粕粉碎至40目篩，并混合均勻。稱取2.5 g烘干至恒重的樣品于三角燒杯中，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同水平的β-甘露聚糖酶，然后依次加入25 ml緩沖液、15 ml胃蛋白酶液，用1∶3 HCl將溶液pH值調(diào)至3.0。在溫度（40±1）℃、振蕩速率為50 r/min的恒溫振蕩器上消化4 h。取出冷卻后，預(yù)調(diào)pH值至弱酸性，加入15 ml胰酶液，用7.5 mol/l的KOH溶液將pH值調(diào)至7.0。然后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，在上述相同條件下再消化4 h。消化結(jié)束后，用紗布過(guò)濾。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

上述濾液經(jīng)處理后用氣相色譜儀測(cè)定，根據(jù)氣象色譜分析結(jié)果，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出各單糖含量，參考劉強(qiáng)（1998）方法[4]，操作步驟根據(jù)具體情況稍作變動(dòng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2003初步整理。采用SPSS17.0分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行Duncan's法多重比較，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶對(duì)豆粕的酶解效果（見(jiàn)表1）

表1 β-甘露聚糖酶對(duì)豆粕的酶解效果（g/kg）

由表1可知，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組可溶性甘露糖含量分別比對(duì)照組（Ⅰ組）增加3.0%、3.9%、4.6%，差異顯著（P＜0.05），Ⅴ組可溶性甘露糖含量比Ⅱ組增加3.2%，差異顯著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三組之間，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三組之間以及Ⅱ與對(duì)照組之間差異均不顯著（P＞0.05）。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組可溶性葡萄糖含量分別比對(duì)照組（Ⅰ組）增加4.3%、4.9%、6.1%，差異顯著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三組之間以及Ⅱ組與對(duì)照組之間差異均不顯著（P＞0.05）?？紤]成本因素，確定β-甘露聚糖酶的添加量為0.8%。

2.2 β-甘露聚糖酶對(duì)棉粕的酶解效果（見(jiàn)表2）

表2 β-甘露聚糖酶對(duì)棉粕的酶解效果（g/kg）

由表2可知，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組可溶性甘露糖含量比對(duì)照組（Ⅰ組）分別增加7.4%、8.6%、8.9%，差異顯著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三組之間以及Ⅱ組與對(duì)照組之間差異均不顯著（P＞0.05）。Ⅳ、Ⅴ組可溶性葡萄糖含量比對(duì)照組（Ⅰ組）分別增加9.1%、10.5%，差異顯著（P＜0.05），Ⅴ組可溶性葡萄糖含量比Ⅱ組增加6.3%，差異顯著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三組之間，Ⅱ與Ⅲ組以及Ⅱ組與對(duì)照組之間差異均不顯著（P＞0.05）?？紤]成本因素，確定β-甘露聚糖酶的添加量為0.8%。

2.3 β-甘露聚糖酶對(duì)菜粕的酶解效果（見(jiàn)表3）

表3 β-甘露聚糖酶對(duì)菜粕的酶解效果（g/kg）

由表3可知，Ⅳ、Ⅴ組可溶性甘露糖含量比對(duì)照組（Ⅰ組）分別增加6.6%、9.5%，差異顯著（P＜0.05），Ⅳ與Ⅴ組以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組之間差異均不顯著（P＞0.05）。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組可溶性葡萄糖含量比對(duì)照組（Ⅰ組）分別增加12.2%、14.6%、16.7%，差異顯著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三組之間以及Ⅱ與對(duì)照組之間差異均不顯著（P＞0.05）?？紤]成本因素，確定β-甘露聚糖酶的添加量為1.6%。

3 討論

近年來(lái)，在飼用酶制劑研究領(lǐng)域?yàn)榱烁?jiǎn)便、快捷的評(píng)估酶制劑的作用效果做了大量的研究。酶制劑評(píng)定方法主要有體外法和體內(nèi)法。體外法是指通過(guò)模擬動(dòng)物消化道環(huán)境對(duì)酶制劑作用效果進(jìn)行評(píng)定的一種方法，此方法具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便快捷、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前，將體外法和體內(nèi)法的結(jié)合應(yīng)用是評(píng)估酶制劑作用效果研究熱點(diǎn)。在研究酶制劑的作用效果時(shí)，首先通過(guò)體外消化試驗(yàn)對(duì)其作用效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和篩選，再用動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，最終得到相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果[6]。

非淀粉多糖根據(jù)其水溶性可分為可溶性非淀粉多糖和不溶性非淀粉多糖[7]，可溶性非淀粉多糖的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其具有較強(qiáng)持水能力，溶解后產(chǎn)生黏性，這也正是可溶性非淀粉多糖產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用的主要原因[8-9]。餅粕類原料中β-甘露聚糖被β-甘露聚糖酶降解產(chǎn)生的單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖，能夠被動(dòng)物吸收利用，給機(jī)體提供能量。因此，通過(guò)氣相色譜儀檢測(cè)可溶性甘露糖和葡萄糖的生成量，可直接反映β-甘露聚糖酶對(duì)豆粕、棉粕以及菜粕等的降解效果。

小腸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，飼料碳水化合物在十二指腸由腸黏膜產(chǎn)生的二糖酶徹底分解成單糖（葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和核糖等）被吸收。日糧中添加β-甘露聚糖酶能水解β-甘露聚糖中的β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵，將其降解為甘露糖、葡萄糖等，促進(jìn)機(jī)體消化和吸收，提高飼料利用率，改善生產(chǎn)性能。王潔等（2011）研究了棉粕非淀粉多糖的體外酶解效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘露聚糖酶濃度為4 000 U/kg時(shí)，棉粕甘露糖和葡萄糖降解效果最明顯，降解率分別為19.89%和13.74%，總可溶性非淀粉多糖降解率最大為10.38%[10]。本試驗(yàn)中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組豆粕可溶性甘露糖和葡萄糖含量比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組棉粕可溶性甘露糖含量比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），可溶性葡萄糖含量Ⅳ、Ⅴ組比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；菜粕可溶性甘露糖含量Ⅳ、Ⅴ組比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），可溶性葡萄糖含量Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組比對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)。結(jié)果表明，隨著β-甘露聚糖酶添加量的提高，可溶性甘露糖和葡萄糖含量逐漸增加，但β-甘露聚糖酶對(duì)兩種糖產(chǎn)量的影響并不一致。一方面是因?yàn)椴煌孜铴?甘露聚糖含量不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的甘露糖和葡萄糖量有一定的差異；另一方面盡管酶作用底物相同，但由于酶制劑本身的活性受很多因素影響，造成β-甘露聚糖酶對(duì)可溶性甘露糖和葡萄糖產(chǎn)量的影響不一致。

4 小結(jié)

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，豆粕、棉粕及菜粕中分別添加0.8%、0.8%和1.6%的 β-甘露聚糖酶時(shí)，能夠有效降解其中的可溶性β-甘露聚糖，顯著增加可溶性甘露糖和葡萄糖的含量，提高飼料的利用率。