骶神經(jīng)電刺激對(duì)脊髓損傷大鼠腸黏膜機(jī)械屏障的保護(hù)作用*

白春宏，劉 浩，李雙英，彭 朋，寧麗娜

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱一科，2.腦科分院，3.中醫(yī)科，天津300162；4.武警后勤學(xué)院軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室，天津300309）

急性完全性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）患者除了運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)障礙，通常還有自主神經(jīng)功能障礙，主要包括心血管、性、膀胱和腸道功能障礙［1］。其中，腸道功能障礙逐漸被認(rèn)為是影響脊髓損傷患者身心健康的重要因素之一。SCI后腸道功能障礙主要表現(xiàn)為便秘、大便失禁、自主反射失調(diào)、腹痛腹脹等。在嚴(yán)重的情況下，還將出現(xiàn)腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。Kamm等證實(shí)刺激骶神經(jīng)可以改善SCI患者的排便的頻率、糞便傳輸時(shí)間等。Uludag等也證實(shí)通過(guò)骶神經(jīng)電刺激62例便失禁患者的研究發(fā)現(xiàn)，電刺激S3或S4可以誘導(dǎo)全結(jié)腸產(chǎn)生順行壓力波，可加快排便頻率及數(shù)量。Bai等通過(guò)骶神經(jīng)電刺激兔子的骶3神經(jīng)根，發(fā)現(xiàn)刺激后兔子的腸道癥狀、菌群移位、內(nèi)毒素血癥得到改善［2］。完整的腸道功能為機(jī)體提供屏障保護(hù)，可防止腸道內(nèi)微生物移位和內(nèi)毒素吸收，主要包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以機(jī)械屏障最為重要。骶神經(jīng)刺激（sacral nerve stimulation，SNS）對(duì) SCI后腸道機(jī)械屏障的具體保護(hù)作用仍未被闡明。所以本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討SNS對(duì)SCI大鼠腸道機(jī)械屏障的保護(hù)作用，為其在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和藥品

Wistar大鼠56只，體重250～300 g（北京維通利華公司），雌雄不拘。鱟試劑盒購(gòu)自廣州安度斯生物有限公司，Rabbit anti-ZO-1、zeocin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，氯化銀銀絲記錄電極、雙極刺激電極、98 g動(dòng)脈瘤夾購(gòu)自成都儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（N）、SCI模型組（SCI）和骶神經(jīng)電刺激組（electriy stimulation，ES）。SCI（3小組，每小組8只，脊髓離斷、骶神經(jīng)不做刺激，脊髓離斷時(shí)間分為24、48和72 h）和ES（3小組，每小組8只，脊髓離斷、最佳刺激電壓刺激骶3神經(jīng)根，刺激時(shí)間分為24、48和72 h）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如有死亡，采用同標(biāo)準(zhǔn)的大鼠用同樣的辦法補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)前置22℃～25℃室溫，普通飼料喂養(yǎng)1周，使其適應(yīng)。

1.3 急性完全性脊髓損傷模型建立及骶神經(jīng)根電極置入

大鼠麻醉后俯臥位固定于鼠板上，定位T6棘突，刮毛刀刮毛，碘伏消毒。手術(shù)暴露脊髓，用神經(jīng)剝離器輕輕挑起后，采用Fehlings法，用98 g動(dòng)脈瘤夾橫行鉗夾約1 min，見(jiàn)雙下肢抽搐停止。去除動(dòng)脈瘤血管夾，沖洗傷口后縫合，無(wú)菌包扎。定位右側(cè)骶3神經(jīng)孔，脫毛劑脫毛后，局部消毒，暴露右側(cè)骶3神經(jīng)孔，置人電極，根據(jù)刺激時(shí)尾部肌肉是否收縮確定電極位置，沖洗傷口后縫合，導(dǎo)線置于皮下，由后背引出，無(wú)菌包扎。損傷后2 h開(kāi)始刺激，刺激電壓為 4 V，波寬 0.21 ms，頻率 15 Hz，刺激時(shí)間 10 s，間歇時(shí)間20 s。每次刺激10 min，休息10 min，共持續(xù)2 h。每天 8∶00-10∶00，18∶00-20∶00刺激兩次［2］。

1.4 示蹤菌定植

按照50μg／ml的濃度加入zeocin抗生素于無(wú)菌蒸餾水中，給予大鼠連續(xù)飲用7 d，在大鼠飲用加入zeocin抗生素?zé)o菌蒸餾水的第4、5天按 10 ml／kg，1次／天給大鼠灌入pSELECT-GFPzeo-mcs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的大腸桿菌菌液，灌胃前灌飼1.5%1 ml碳酸氫鈉溶液。在大鼠飲用加入zeocin抗生素?zé)o菌蒸餾水的第5、6、7天連續(xù)3 d采集糞便標(biāo)本于LB帶抗生素培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，熒光顯微鏡下鑒別細(xì)菌。

1.5 組織學(xué)觀察

取小腸，用4%甲醛液固定，經(jīng)梯度乙醇系列脫水，二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察記錄。

1.6 透射電鏡

取面積為1 mm×1 mm的小腸組織放入4%戊二醛固定；0.1 mol／L PBS漂洗兩次；1%鋨酸固定2 h；丙酮梯度脫水；環(huán)氧樹(shù)脂618包埋；半薄切片定位；超薄切片，鈾染，鉛染；透射電鏡觀察。

1.7 內(nèi)毒素測(cè)定

用無(wú)熱源注射器抽取大鼠肝門(mén)靜脈血適量，取掉針頭貼壁注入無(wú)熱源管中；靜置30 min，離心5 min（3 500 r／min）；取血清 0.1 ml，加入鱟試劑盒中的試驗(yàn)用水0.9 ml，混勻后置75℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫備用；利用鱟試劑盒（廣州安度斯生物有限公司產(chǎn)品）定量測(cè)定血清內(nèi)毒素。

1.8 細(xì)菌培養(yǎng)

無(wú)菌條件下采取大鼠小塊肝臟和脾臟及腸系膜淋巴結(jié)各0.2 g并分別研碎；將研碎組織放入裝有無(wú)菌1 ml生理鹽水的離心管中混勻；取0.2 ml混勻后組織均勻涂抹于LB培養(yǎng)基上，24 h（37℃）培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)、數(shù)量；熒光顯微鏡下觀察，鑒定細(xì)菌。

1.9 免疫組化檢測(cè)

常規(guī)脫蠟和水化；3%H2O2滴加在石蠟切片組織上，室溫靜置10 min，PBS洗5 min×3次；抗原修復(fù)：將 0.01 mol／L枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）放置于微波爐里加熱至沸騰后將石蠟切片放入，斷電，間隔5～10 min，反復(fù)1～2次，冷卻至室溫，PBS洗5 min×3次；滴加5%BSA封閉液，放入濕盒后，將濕盒置于37℃恒溫箱中20 min；甩去5%BSA封閉液滴加Ι抗50μl，4℃過(guò)夜；4℃過(guò)夜后，放置于37℃恒溫箱中復(fù)溫45 min，PBS洗5 min×3次；滴加Ⅱ抗45～50 μl，放置于37℃恒溫箱中1 h，PBS洗5 min×3次；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來(lái)水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.10 Western blot方法檢測(cè)組織中ZO-1蛋白含量

向2 ml離心管中加入1 ml PMSF和10μl RIPA充分混勻，用干凈的剪刀將0.2 g小腸組織塊剪碎后加入到離心管中，使用組織勻漿器勻漿，勻漿后放置冰上裂解30 min；離心取蛋白沉淀；Lowry法測(cè)蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF 2 h，洗膜后加入ZO-1一抗，4℃反應(yīng)過(guò)夜，次日洗膜，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)1 h。洗膜，加入 ECL顯色劑，X片顯影。以β-actin為內(nèi)參。用 image J圖象分析軟件，根據(jù)光密度定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析，不同率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

SCI后立即出現(xiàn)尿潴留，隨著時(shí)間的推移，腹脹進(jìn)行性加重，剖腹觀察小腸腸管脹氣明顯，腸壁透光性增強(qiáng)；盲腸、結(jié)腸和直腸大量糞便堆積，觸之較硬結(jié)，遠(yuǎn)端腸道蠕動(dòng)明顯減弱；ES大鼠，一般情況及剖腹后觀察，腸道功能改善明顯（圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）。

2.2 腸道形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 光鏡：N組小腸黏膜保持完整，腸絨毛形態(tài)正常；SCI組24 h：黏膜下血管充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。48 h：黏膜下血管充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量滲出物。72 h：黏膜下水腫、淤血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛破壞，上皮細(xì)胞壞死、大量滲出。ES組24 h：黏膜下血管輕微充血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。48 h：黏膜下血管輕度充血，少量滲出物，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。72 h：黏膜下血管輕度充血，少量滲出物，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）。

2.2.2 電鏡：N組可見(jiàn)兩個(gè)吸收細(xì)胞之間正常的緊密連接、中間連接和橋粒，小腸微絨毛排列整齊；SCI組24 h：黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞間隙略增寬。48 h：黏膜上皮細(xì)胞水腫嚴(yán)重，細(xì)胞間隙明顯增寬。72 h：黏膜上皮細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分細(xì)胞壞死，細(xì)胞間隙明顯增寬，微絨毛水腫、折斷并脫落。ES組24 h：黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞間隙無(wú)增寬。48 h：黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞間隙略增寬。72 h：黏膜上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞間隙略增寬，微絨毛變疏松（圖3，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）。

2.3 內(nèi)毒素結(jié)果

SCI組和ES組不同時(shí)間段與正常組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ES組與 SCI組不同時(shí)間段之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＜0.01，表1）。

2.4 各器官細(xì)菌培養(yǎng)

肝臟：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組48 h細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率差異有顯著性（P＜0.05），24、72 h及總數(shù)差異有顯著性（P＜0.01）；淋巴結(jié)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 24、72 h細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），48 h及總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；脾臟：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組48 h細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24、72 h及總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 2）。

2.5 腸組織ZO-1表達(dá)

各組大鼠腸道組織提取蛋白后，經(jīng)Western blot檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1的變化趨勢(shì)，結(jié)果證實(shí)，各組ZO-1蛋白水平的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組大鼠腸道石蠟包埋切片后，經(jīng)免疫組化觀察緊密連接蛋白ZO-1的分布，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移對(duì)照組ZO-1的分布出現(xiàn)不同程度的排列散亂、不規(guī)則，實(shí)驗(yàn)組ZO-1的分布得到不同程度的改善（圖4、表3、圖 5，圖 5見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ）?！?/p>

Tab.1 Endotoxin levels in blood serum（U／ml，，n＝10）

Tab.1 Endotoxin levels in blood serum（U／ml，，n＝10）

N：Normal group；SCI：Spinal cord injury；ES：Electrie Stiwulation**P＜0.01 vs N；＃＃P＜0.01 vs SCI

Group 24 h 48 h 72 h N 0.698±0.043 — —SCI 4.114±1.055** 6.936±1.497** 8.702±1.666**ES 2.583±0.262**＃＃ 1.156±0.299**＃＃ 0.925±0.145**＃＃

Tab.2 Bacterial translocation in differeft organs（，n＝8）

Tab.2 Bacterial translocation in differeft organs（，n＝8）

ES：Electrie stimulation；SCI：Spinal cord injury*P＜0.05，**P＜0.01 vs ES

Group Lymph Nodes Liver Spleen 24 h 48 h 72 h Total ES 50% 38% 50% 46% 38%25% 0 21% 13% 13% 25%17%SCI 100%*100%**100%*100%**100%**88%*100%**96%**88%**75%*100%**88%24 h 48 h 72 h Total 24 h 48 h 72 h Total**

Tab.3 ZO-1 Western blot quantitative analysis（x±s）

3 討論

完整的腸道功能為機(jī)體提供屏障保護(hù)，防止腸道內(nèi)微生物移位和內(nèi)毒素吸收，主要包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以機(jī)械屏障最為重要。機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為黏液層、完整的腸粘膜上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間的緊密連接［3］。粘液層能夠阻止大顆粒物質(zhì)包括大部分的細(xì)菌與腸道上皮細(xì)胞的直接接觸［4］。完整的腸上皮細(xì)胞選擇通透性能夠有效阻止細(xì)菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過(guò)腸黏膜組織進(jìn)入血液［5］。腸上皮細(xì)胞間通道是封閉的，這種生理功能是由相鄰上皮細(xì)胞之間的連接復(fù)合體完成的，其中緊密連接起著主要的作用。緊密連接是由多種跨膜蛋白、膜蛋白以及調(diào)節(jié)分子所構(gòu)成，跨膜蛋白調(diào)節(jié)著緊密連接的通透性，其最重要的蛋白為封閉蛋白家族，ZO-1作為其中的關(guān)鍵蛋白在緊密連接各蛋白的組裝和維護(hù)方面起著至關(guān)重要的作用［6］。腸道的蠕動(dòng)是腸道機(jī)械屏障的另一重要組成部分［7］。正常的腸道菌群構(gòu)成腸道里的非特異性免疫屏障，當(dāng)腸道細(xì)菌的數(shù)量、種類或者位置發(fā)生變化時(shí)，腸道的穩(wěn)態(tài)發(fā)生破壞，腸道的機(jī)械屏障就會(huì)遭到破壞，從而使腸道的通透性增加［8］。SCI時(shí)可直接或間接破壞腸道粘液層、腸道上皮細(xì)胞、細(xì)胞間的緊密連接、破壞正常的腸道菌群的平衡以及造成腸道蠕動(dòng)的紊亂，造成腸機(jī)械屏障的破壞。

如何防治SCI后腸道功能障礙及相關(guān)并發(fā)癥方法很多，但都不是很理想。隨著SNS的出現(xiàn)，給我們帶來(lái)了希望。大多數(shù)SCI患者出現(xiàn)長(zhǎng)期的腹脹、腹痛及發(fā)熱等表現(xiàn)，有的甚至出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合癥、膿毒血癥、敗血癥甚至感染性休克等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，早期解決排便問(wèn)題、恢復(fù)腸道功能尤為關(guān)鍵。骶副交感中樞對(duì)結(jié)腸動(dòng)力起著重要的調(diào)節(jié)作用，特別是在排便時(shí)，肛門(mén)括約肌主要由骶髓發(fā)出的陰部神經(jīng)支配（S2-S4）［9］。研究表明，S3對(duì)結(jié)腸及直腸運(yùn)動(dòng)功能起著主要的支配作用并且對(duì)肛門(mén)外括約肌支配功能的影響也最為顯著。刺激停止后，立即舒張，而直腸則緩慢松弛，引起自發(fā)性排便，電刺激S3還可以誘導(dǎo)全結(jié)腸產(chǎn)生順行壓力波，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加快排便頻率及數(shù)量［10］。因此本實(shí)驗(yàn)觀察了SNS對(duì)SCI后腸道動(dòng)能的改善情況，尤其是對(duì)機(jī)械屏障的改善情況發(fā)現(xiàn)：SNS確實(shí)能夠增強(qiáng)腸道的蠕動(dòng)，能較好的改善腸道功能，排出腸內(nèi)容物，使腸道菌群數(shù)量減少，上皮細(xì)胞、腸絨毛以及緊密連接破環(huán)得到不同程度的改善，血清內(nèi)毒素水平下降和細(xì)菌移位發(fā)生減少。SNS模擬腸道生理機(jī)制，以純物理的方法持續(xù)、可控的恢復(fù)腸道功能，從而改善生活質(zhì)量，同時(shí)預(yù)防腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥，減少病死率，具有較好的應(yīng)用價(jià)值及社會(huì)效益。但SNS是否對(duì)腸道神經(jīng)系統(tǒng)及免疫屏障等有改善作用，還需要下一步繼續(xù)研究。

總之，電刺激S3神經(jīng)根能較好促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障，改善腸黏膜屏障功能，進(jìn)而減輕內(nèi)毒素血癥和腸道細(xì)菌移位，為臨床預(yù)防脊髓損傷截癱后內(nèi)毒素血癥和腸道菌群移位感染的發(fā)生、減少全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)提供了一種有效的選擇。

［1］Mili′cevi′c S，Bukumiri′c Z，Nikoli′c AK，et al.Demographic characteristics and functional outcomes in patients with traumatic and nontraumatic spinal cord injuries［J］.Vojnosanit Pregl，2012，69（12）：1061-1066.

［2］ Bai C，An H，Wang S，et al.Treatment and prevention of bacterial translocation and endotoxemia with stimulation of the sacral nerve root in a rabbit model of spinal cord injury［J］.Spine，2011，36（5）：363-371.

［3］ Turner JR.Intestinal mucosal barrier function in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2009，9（11）：799-809.

［4］ Hansson GC，Johansson ME.The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria［J］.Gut Microbes，2010，1（1）：51-54.

［5］ Shen L.Functional morphology of the gastrointestinal tract［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2009，337：1-35.

［6］ Rodriguez-Lagunas MJ，F(xiàn)errer R，Moreno JJ.Effect of eicosapentaenoic acid-derived prostaglandin E3 on intestinal epithelial barrier function［J］.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2013，88（5）：339-345.

［7］ Schietroma M，Pessia B，Carlei F，et al.Intestinal permeability，systemic endotoxemia，and bacterial translocation after open or laparoscopic resection for colon cancer：a prospective randomized study［J］.Int J Colorectal Dis，2013，28（12）：1651-1660.

［8］ Yang J，Liu KX，Qu JM，et al.The changes induced by cyclophosphamide in intestinal barrier and microflora in mice［J］.Eur J Pharmacol，2013，714（1-3）：120-124.

［9］ Fynne L，Worsoe J，Gregersen T，et al.Gastric and small intestinal dysfunction in spinal cord injury patients［J］.Acta Neurol Scand，2012，125（2）：123-128.

［10］ Boyle DJ，Murphy J，Gooneratne ML，et al.Efficacy of sacral nerve stimulation for the treatment of fecal incontinence［J］.Dis Colon Rectum，2011，54（10）：1271-1278.