長鏈非編碼RNA在胰腺癌中的研究進展

馬玲 田孝東 劉笑然 楊尹默

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被認為是基因轉錄中無功能的副產(chǎn)物，長期以來對其重視不足。近年來發(fā)現(xiàn)此類不編碼蛋白的、長度大于200nt的轉錄本不僅在表觀遺傳學修飾、轉錄與轉錄后調(diào)控、維持正常組織的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用，而且通過調(diào)控細胞周期與凋亡影響腫瘤細胞的生長、遷移與侵襲，有望成為潛在的診斷標志物與治療的靶點。

一、lncRNA概述

從生物基因組中轉錄出的轉錄本可以分為兩種：編碼蛋白質(zhì)的信使RNA和非編碼RNA。生物的級別越高，非編碼RNA在基因組中所占比例越大，如在酵母中約占30%，而在人類基因組中已達到98%，但是后者所編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量卻并沒有遠遠超過前者[1]。因此，造成物種差異性的原因可能并不是蛋白質(zhì)序列的不同，而是大量的非編碼RNA在其中起了重要的調(diào)控作用。

非編碼RNA包括長度約為20nt的microRNA以及轉錄本長度大于200nt的lncRNA，它們共同的特點為不編碼蛋白質(zhì)，可以定位于細胞核、細胞質(zhì)及不同的細胞器中。目前對microRNA的研究已經(jīng)相對成熟，但對lncRNA的研究開始較晚。2002年Okazaki等[2]在對小鼠cDNA文庫的測序中首次發(fā)現(xiàn)lncRNA并開始對其功能和分子機制進行系統(tǒng)研究。

lncRNA的序列保守性差，表達具有時空和組織特異性。其生物學來源廣泛：(1)大部分lncRNA是由蛋白質(zhì)編碼基因的結構中斷而形成；(2)經(jīng)染色質(zhì)重組，兩個未轉錄的基因與另一獨立的基因并排重組而產(chǎn)生含多個外顯子的lncRNA；(3)非編碼基因在復制過程中的反移位產(chǎn)生lncRNA；(4)由局部的復制子串聯(lián)產(chǎn)生lncRNA；(5)基因中插入一個轉座成分而形成有功能的lncRNA[3]。

根據(jù)lncRNA在基因組中相對于編碼基因所在的位置可分為以下幾種類型：正義(sense lncRNA)、反義(antisense lncRNA)、雙向(bidirectional lncRNA)、基因內(nèi)區(qū)(intronic lncRNA)、基因間區(qū)(intergenic lncRNA)等。lncRNA位置的不同決定了其功能上的差異。

二、lncRNA的功能

lncRNA可對DNA、RNA以及蛋白質(zhì)進行多個層面的調(diào)控，構成復雜而精細的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，使遺傳信息的表達在空間與時間上具有無限可能性。

1．表觀遺傳學：lncRNA具有印跡基因的作用，可以確保本條染色體上的等位基因獲得表達，從而維持胚胎發(fā)育和個體的正常生長。印跡的丟失?？蓪е履[瘤的形成。如Wilms'瘤患者的印跡基因H19不表達，而H19上游的IGF2過表達[4]。在劑量補償方面，已經(jīng)證明X染色體失活是一種lncRNA的反義鏈轉錄調(diào)控模式。Xist(X inactive specific transcript)基因編碼一段約17kb大小的lncRNA，從轉錄位點開始順式附著于染色質(zhì)，擴散分布于整條染色體導致染色質(zhì)異化，從而使X染色體失活[5]。

2．轉錄調(diào)控：位于蛋白質(zhì)編碼基因上游啟動子區(qū)的lncRNA可以通過干擾與轉錄因子的結合抑制下游基因的表達，或者通過誘導組蛋白修飾或染色體重塑來抑制或促進編碼基因的轉錄。瞬時的lncRNA轉錄也會對基因表達造成長期的影響，產(chǎn)生級聯(lián)反應。lncRNA可作為共因子調(diào)節(jié)轉錄因子的活性。lncRNA還可以通過與影響啟動子結合的抑制性復合物相互作用，封鎖啟動子區(qū)域來調(diào)控RNA聚合酶的活動從而干擾基因表達[6]。

3．轉錄后水平調(diào)控：lncRNA與RNA結合蛋白(RNA-binding proteins)結合形成RNA-蛋白質(zhì)復合體，參與RNA剪接、轉運，維持RNA的穩(wěn)定及降解和翻譯控制等RNA代謝的各個方面，同時也可以調(diào)控RNA結合蛋白的活性，并影響其細胞亞定位。lncRNA與編碼蛋白基因的轉錄產(chǎn)物形成互補雙鏈，以掩蓋mRNA的主順式作用元件，從而調(diào)控基因表達。同時lncRNA可以指導前體mRNA產(chǎn)生不同亞型，如核內(nèi)的肺腺癌轉移相關轉錄子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)可以通過改變SR剪接因子的磷酸化狀態(tài)來調(diào)控mRNA的可變剪接[7]。作為許多小分子RNA的前體，lncRNA還可以在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA、miRNA、piRNA等，調(diào)控基因的表達水平。

三、lncRNA在腫瘤形成中的作用

已證明多種lncRNA在不同腫瘤組織中的表達水平有顯著差異，具有特異性，這些lncRNA可望成為新的腫瘤標志物或治療靶點。lncRNA在腫瘤形成中的作用具有兩面性，有些可作為“癌基因”在不同層面啟動腫瘤的形成，而另外一些則起著類似“抑癌基因”的作用。

1．lncRNA對腫瘤形成的促進作用：(1)促進腫瘤細胞的遷移和侵襲：HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisenseRNA，HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉錄調(diào)控作用的lncRNA，在乳腺癌、結腸癌、肝癌等惡性腫瘤中均有特異性表達，其表達水平的上調(diào)與腫瘤的轉移具有相關性。Gupta等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌MDA-MB-231細胞系中HOTAIR的過表達可以促進細胞的體外侵襲和體內(nèi)轉移。HOTAIR通過改變?nèi)旧w狀態(tài)，將多梳蛋白抑制復合體(polycomb repressive complex2，PRC2)招募到854個基因上(一般情況下這些基因是不與PRC2結合的)，并與PRC2通路的成員SUZ12、EZH2、H3K27me3關系密切，導致了包括HOXD10、PGR、原鈣黏附蛋白基因家族在內(nèi)的許多轉移抑制基因被表觀抑制進而表達下調(diào)。Geng等[9]在肝細胞癌(HCC)細胞系Bel7402中敲除HOTAIR可以減少細胞增殖，并可降低基質(zhì)金屬蛋白酶9和血管內(nèi)皮生長因子的蛋白水平，兩者在細胞遷移和腫瘤轉移中有重要作用。Tano等[10]報道，沉默非小細胞肺癌細胞株A549的MALAT-1的表達可降低肺癌細胞的遷移能力，并影響很多與細胞遷移相關基因的表達，如CTHRC1、CCT4、HMMR以及ROD1等。在MALAT-1敲除的細胞系中，一些mRNA前體的表達水平有所降低。因此認為MALAT-1可在轉錄及轉錄后水平調(diào)控與細胞遷移相關的基因表達來促進細胞遷移。(2)調(diào)控細胞周期及凋亡：Li等[11]在食管鱗狀上皮癌(ESCC)細胞系KYSE510和KYSE180中敲除HOTAIR后降低了細胞克隆形成、遷移和向細胞外基質(zhì)侵襲的能力，改變了周期進程，增加了細胞對凋亡的敏感性?；蛐酒瑱z測結果顯示，HOTAIR在腫瘤形成中調(diào)控細胞遷移和周期的重要區(qū)域有富集現(xiàn)象。Yang等[12]在HCC中發(fā)現(xiàn)了一種特異性高表達的lncRNA，稱為lncRNA-HEIH(lncRNA high expression in HCC)，通過體內(nèi)、體外實驗驗證，lncRNA-HEIH可以將腫瘤細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，有效地抑制腫瘤細胞增殖，并且通過結合zeste同源染色體2(EZH2)招募PRC2，進而抑制EZH2靶基因的表達，發(fā)揮調(diào)控細胞周期的功能。細胞周期激酶抑制因子4b(INK4b)位點的反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 Locus，ANRIL)已被證實存在于pl5/CDKN2B-p16/CDKN2A-pl4/ARF基因簇中，其表達與INK4a的表觀遺傳學沉默相關，而INK4b-ARF-INK4a位點在調(diào)控細胞周期、細胞衰老、干細胞的自我更新和凋亡中具有重要的作用[13]。(3)促進腫瘤的血管生成：Yuan等[14]發(fā)現(xiàn)lncRNA-MVIH(lncRNA associated with microvascular invasion in HCC)不僅在HCC中表達上調(diào)，而且與微血管及淋巴結轉移關系密切。小鼠移植瘤模型顯示，MVIH可以通過抑制磷酸甘油激酶1(PGK1)來激活腫瘤誘導的血管生成從而促進腫瘤生長和肝內(nèi)轉移。

2．lncRNA對腫瘤形成的抑制作用：母系印跡基因MEG3定位于14q32.3，是少數(shù)與抑制腫瘤相關的lncRNA之一，在人類多數(shù)正常組織中均有不同程度的表達，腦組織和垂體中表達最高，而在腫瘤組織及細胞株中表達缺失。MEG3在Hela、MCF-7和H4等腫瘤細胞系中的異常表達可以抑制腫瘤的生長，說明MEG3有潛在的抑制腫瘤細胞生長的功能。Braconi等[15]通過使用基因芯片對肝癌細胞進行分析后發(fā)現(xiàn)，在23 000多條lncRNA中，有712條下調(diào)，而母系表達基因(MEG3)下調(diào)了210倍。且MEG3在4種人類肝癌細胞系中均有顯著下調(diào)，但在非腫瘤細胞的胞質(zhì)中高表達。將MEG3轉染至肝癌細胞高表達，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞生長受到明顯抑制，其分子機制與誘導肝癌細胞凋亡有關。

Huang等[16]發(fā)現(xiàn)了一種在HCC中表達下調(diào)的lncRNA-lncRNA-Dreh，可以抑制HBV相關性腫瘤的生長和轉移。lncRNA-Dreh可與中間絲蛋白結合并抑制其表達，通過改變正常細胞骨架結構來抑制腫瘤轉移。

Mourtada-Maarabouni等[17]發(fā)現(xiàn)一種反式調(diào)控lncRNA——生長休止特定轉錄5(growth arrest-specific transscript 5，GAS5)，對控制哺乳動物的細胞凋亡和增殖有重要作用，可提高細胞對凋亡誘導劑的敏感性而促進凋亡，同時抑制腫瘤細胞增殖。GAS5的轉錄水平在乳腺癌標本及細胞系中均有明顯下調(diào)，從而促進了腫瘤的生長。

四、lncRNA與胰腺癌

1．HOTAIR：目前已知HOTAIR參與了多種腫瘤的生物進程，是一個重要的腫瘤預后影響因素。Kim等[18]首次在胰腺癌中檢測了HOTAIR的表達，結果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中HOTAIR表達水平上升，而且與腫瘤惡性程度(TNM分期)和不良預后相關。HOTAIR在胰腺癌不同細胞系中表達水平有差異，如在PANC1和L3.6pL中明顯升高，而在PANC28、MiaPaCa-2和BxPC3中低表達。功能學實驗證實HORAIR可減少細胞增殖和腫瘤侵襲力，改變細胞周期進程，并且誘導凋亡。在胰腺癌細胞系PANC1中敲除HOTAIR后，有20個重要的基因群因此發(fā)生了變化，而其中10個與調(diào)控細胞周期有關；在L3.6pL中敲除HOTAIR還可在體積和重量上抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長?；蛐酒治鼋Y果顯示，HOTAIR在胰腺癌和乳腺癌中調(diào)控的基因群有部分重疊，但其作用位點并不完全相同，HOTAIR和PRC2在胰腺癌中主要共同調(diào)控基因GDF15。通過敲除兩個細胞系EZH2，并運用免疫共沉淀分析后發(fā)現(xiàn)，HOTAIR介導的基因抑制既有PCR2依賴性也有非PCR2依賴性。此研究證明HOTAIR在胰腺腫瘤中不僅是一種原癌基因，而且在不同腫瘤的形成中存在多種調(diào)控機制。

2．H19：印跡基因H19在個體胚胎發(fā)育階段有高表達，出生后即表達受抑，然而在許多腫瘤組織發(fā)現(xiàn)其有高表達。Sorin等[19]發(fā)現(xiàn)H19在85%的胰腺癌組織中有中、高度表達，因此設計了BC-819(或稱DTA-H19)聯(lián)合吉西他濱用于治療胰腺癌動物模型的實驗方案。BC-819是一種攜帶編碼白喉毒素A鏈(DTA)的雙鏈DNA質(zhì)粒，而DTA的基因轉錄是由H19啟動子調(diào)控的，因此可應用于治療H19高表達的腫瘤。BC-819已經(jīng)在人體膀胱癌的臨床研究中成功抑制了腫瘤的生長[20]，并且證明BC-819可直接介導細胞毒作用于腫瘤細胞，不會影響周圍正常組織。BC-819和吉西他濱均可影響細胞生長，吉西他濱在上游干擾有絲分裂中DNA的合成，而BC-819在下游對H19高表達的腫瘤細胞抑制其蛋白質(zhì)合成，誘導凋亡。在地鼠原位胰腺癌的病理切片中可以看到，經(jīng)BC-819和吉西他濱聯(lián)合治療，腫瘤組織壞死區(qū)域明顯擴大。雙藥聯(lián)合不僅可以延緩腫瘤進程，縮小腫瘤體積，增加其可被手術切除的概率，而且經(jīng)聯(lián)合治療的胰腺癌動物均未出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤轉移。但是BC-819的注射只會起到局部效應，必須結合藥物化療才能增加腫瘤對藥物的反應和改善預后。Amit等[21]發(fā)現(xiàn)對于H19表達較低的腫瘤采用H19與IGF2雙啟動子調(diào)控的毒素載體H19-DTA-(IGF2)-P4-DTA，抑制腫瘤的效果更好。Hanna等[22]將BC-819應用于9例不可切除及無轉移的局部進展期胰腺癌病例的臨床治療，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過BC-819局部注射后接受化療或放療的2例患者，其原發(fā)腫瘤降期并可被手術切除，其余患者或局部腫瘤反應良好或未再進展，因此研究者認為經(jīng)超聲或CT引導下BC-819局部注射(每周2次、每次劑量至少為8 mg)聯(lián)合化療可使胰腺癌患者顯著受益。

3．MALAT-1：MALAT-1在很多腫瘤組織中表達上調(diào)，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌和宮頸癌。而目前尚無MALAT-1與胰腺癌相關性的直接研究結果，但有多篇文獻報道了可能受MALAT-1調(diào)控的幾種轉錄因子的表達水平在胰腺癌中有顯著變化。潛在的腫瘤抑制轉錄因子RUNX1(21q22.3，又稱為AML1)在胰腺癌組織中表達丟失[23]。Zhang等[24]在胰腺癌細胞系中敲除Snail后通過誘導凋亡抑制了腫瘤細胞和移植瘤的生長，并且增加了對化療藥物和放射治療的敏感性，提示轉錄因子Snail與胰腺癌的抗凋亡及化療抵抗有關。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，RUNX1和Snail都在MALAT-1上游1 kb啟動子序列潛在的轉錄因子結合位點上，其TF score cutoff值為98%。另一方面，Ji等[25]發(fā)現(xiàn) MALAT-1在正常胰腺、肺組織中高表達，在其他組織中中度或無表達；Yamada等[26]研究也發(fā)現(xiàn)MALAT-1在正常胰腺組織、肺和前列腺中都有表達，而在子宮組織中不表達。這兩個研究結果間接提示，MALAT-1在胰腺癌的形成過程可能發(fā)揮了重要作用。 在對MALAT-1研究較為深入的非小細胞肺癌細胞中，此基因可促進腫瘤生長和集落的形成；干擾其表達后，肺腺癌細胞的遷移能力受到顯著抑制。而在胰腺癌中，腫瘤的侵襲轉移是導致其惡性程度增加及治療困難的重要因素，因此研究MALAT-1的促腫瘤侵襲轉移作用，將會是探索lncRNA在胰腺癌中分子機制的可能方向。

4．PVT1：吉西他濱是治療進展期胰腺癌的一線化療藥物，但由于不同個體對吉西他濱的敏感性不同，使得化療效果無法預測。You等[27]應用全基因組和基于piggyBac轉座子的基因篩選平臺，發(fā)現(xiàn)PVT1(plasmacytoma variant translocation 1 gene)為胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性的調(diào)控因子。PVT1基因通過調(diào)控DNA重組、MYC基因共同擴增及干預部分microRNA的表達，在許多人類腫瘤的形成過程中都發(fā)揮了重要作用。piggyBac轉座子載體被插入到PVT1的內(nèi)含子3后，整合基因開始反義轉錄，導致PVT1的功能性失活，也可能導致上游的MYC轉錄產(chǎn)物的潛在功能性失活。反義全長的PVT1 cDNA在初始胰腺癌細胞系AsPC-1中過表達后導致的功能性PVT1失活可以增加腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性；而在正義方向過表達此基因可降低該細胞對吉西他濱的敏感性。

5．其他：人類基因組中，基因內(nèi)區(qū)和基因間區(qū)lncRNA在調(diào)控腫瘤組織基因表達方面所起的作用不盡相同，兩者在胰腺癌中的表達模式和生物關聯(lián)性也有差異。Tahira等[28]運用基因芯片等生物信息學技術分析了38例胰腺導管腺癌(PDAC)腫瘤組織和非腫瘤組織標本后發(fā)現(xiàn)，基因內(nèi)區(qū)和基因間區(qū)lncRNA在兩者中都有表達。承載基因間區(qū)lncRNA的基因位點在PDAC中有差異性表達，這些基因位點在組成MAPK通路的基因群處富集，可能與MAPK通路調(diào)控的腫瘤轉移相關。定向特異性RT-PCR結果顯示，基因內(nèi)區(qū)lncRNA可以通過正義、反義、雙向機制與編碼蛋白質(zhì)的mRNA進行相互作用。一些基因內(nèi)區(qū)lncRNA如PPP3CB、MAP3K14、DAPK1等基因位點在轉移癌灶中有差異性表達。PDAC或轉移癌的發(fā)生與胰腺組織中基因間區(qū)lncRNA的豐度有相關性，提示這類轉錄產(chǎn)物與胰腺癌的生物進程、惡性轉化和轉移有潛在的關系。

lncRNA與腫瘤的相關性及其分子機制的研究目前雖剛剛起步，但已發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中都有l(wèi)ncRNA的顯著變化，推測其對腫瘤的生長調(diào)控涵蓋了腫瘤發(fā)生的整個過程。一些lncRNA被認為是特定腫瘤的原癌基因、獨立危險因子、預后預測參數(shù)以及治療的新靶點。尤其在轉移率高及預后差的胰腺癌中，lncRNA具有廣闊的研究空間，其促腫瘤轉移機制、調(diào)控對化療藥物的敏感性等問題的研究將為胰腺癌的診斷和治療帶來重大突破。由于lncRNA的數(shù)量、種類繁多，結構復雜，保守性較差，功能狀態(tài)未知等因素的影響，需要研究者采用更合理有效的實驗方案及技術來確保實驗結果的可靠性，以期為包括胰腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤篩選出更多的具有更高特異性的lncRNA。

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