來曲唑聯(lián)合依維莫斯對人子宮內(nèi)膜癌細胞的體外抑制作用及機制

楊 堯，陸曉媛

(1徐州醫(yī)學院，徐州221000;2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有上升趨勢。其確切病因目前仍無定論，大多數(shù)學者認為與長期持續(xù)的雌激素刺激且無孕激素拮抗有關(guān)［1］。絕經(jīng)后女性雌激素主要由腎上腺皮質(zhì)分泌的雄烯二酮經(jīng)芳香化酶作用轉(zhuǎn)化而來［2］，芳香化酶抑制劑能抑制芳香化酶的活性，降低由雄激素轉(zhuǎn)化的雌激素水平，進一步阻斷雌激素刺激腫瘤細胞的生長。PI3K/Akt/mTOR信號通路與細胞生長、增殖及分化密切相關(guān)，該通路在多種惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌及結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3～7］。在此通路中，PTEN通過抑制PIP2向PIP3轉(zhuǎn)化，進而抑制Akt1和mTOR活化，是PI3K/Akt/mTOR信號通路的負性調(diào)節(jié)因子。有研究［8.9］表明，在高濃度雌激素刺激下，PTEN 的表達和作用增強，突變率增加。2013年4～12月，我們觀察了芳香化酶抑制劑來曲唑和mTOR特異性抑制劑依維莫斯對人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的體外抑制作用及其可能的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞株及RPMI-1640培養(yǎng)基購自南京凱基公司;AnnexinV-FITC試劑盒購自上海碧云天公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品;來曲唑為連云港恒瑞制藥公司產(chǎn)品;依維莫斯為瑞士諾華公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及干預 Ishikawa細胞于37℃、5%CO2的條件下于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，以3×104/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)基后分為三組。對照組加DMSO，來曲唑組予來曲唑10－7mol/L，聯(lián)合組予來曲唑及依維莫斯(濃度分別為10－7mol/L及2 μg/mL);來曲唑溶于DMSO，配成10－2mol/L母液，依維莫斯溶于DMSO，配成10 mg/mL母液，分裝－20℃保存。按實驗需要用RPMI-1640培養(yǎng)液逐級稀釋成所需濃度。每組設(shè)5個復孔。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 細胞增殖抑制率 采用 MTT比色法。各組干預24、48、72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育 4 h。棄上清液，每孔加入150 μL，避光振蕩10 min后選擇492 nm波長，在酶標儀上測定吸光度(OD)值并繪制曲線。計算細胞抑制率。細胞抑制率=(1－用藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 細胞凋亡率 采用 AnnexinV/PI雙染法。各組干預24、48 h后消化細胞，1 200 r/min離心5 min去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，棄上清，收集細胞。500 L Binding Buffer重懸細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室溫中避光孵育 30 min，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測。

1.2.4 PTEN、4E-BP1 蛋白表達 采用 Western blot法檢測PTEN(人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因)、4E-BP1(真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白)。取生長分裂期Ishikawa細胞，胰酶消化后置于6孔板內(nèi)，每孔約1×105個細胞，體積約5 mL，24 h細胞貼壁后移去所有上清，根據(jù)分組加入相應(yīng)干預藥物，每孔最終體積5 mL。于藥物作用24 h后，反復凍溶后加入蛋白裂解液，收集細胞，提取蛋白，并進行蛋白定量。取15 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜上，分別加入一抗PTEN(1∶1 000)、4EBP1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃搖床振蕩過夜后洗滌并加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育30 min，Washing Buffer洗滌后，置掃描儀掃描NC膜。結(jié)果分析采用Image J分析軟件系統(tǒng)處理，以目的蛋白條帶的吸光度容積與β-actin條帶吸光度容積的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用±s表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析(One-WayANOVA)，組間兩兩比較用LSD或 Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖抑制率與凋亡率 隨藥物作用時間延長，來曲唑組及聯(lián)合組細胞增殖抑制率逐漸升高;以作用72 h為最高。聯(lián)合組各時間點細胞增殖抑制率明顯高于來曲唑組。與對照組相比，來曲唑組及聯(lián)合組P均＜0.05;相同時段各組之間兩兩相比，P均 ＜0.05;同組各時段之間兩兩相比，P均 ＜0.05。隨藥物作用時間延長，來曲唑組及聯(lián)合組細胞凋亡率逐漸升高(P＜0.05);聯(lián)合組各時間點凋亡率均明顯高于來曲唑組(P均 ＜0.05)。見表 1。

表1 各組細胞增殖抑制率及凋亡率比較(%，±s)

表1 各組細胞增殖抑制率及凋亡率比較(%，±s)

組別 n 24 h抑制率 凋亡率48 h抑制率 凋亡率72 h抑制率對照組512.3 ±0.72 15.4 ±0.16來曲唑組 5 27.5 ±1.9 36.9 ±0.60 31.1 ±1.1 40.3 ±0.73 38.0 ±4.2聯(lián)合組 5 44.3 ±2.6 52.7 ±0.81 50.9 ±1.7 59.6 ±1.03 54.7±5.1

2.2 PTEN、4E-BP1蛋白表達 用藥24 h，來曲唑組及聯(lián)合組PTEN表達均升高(P＜0.05)，聯(lián)合組升高幅度大于來曲唑組(P＜0.05);4E-BP1表達較用藥前下降(P＜0.05)，聯(lián)合組下降幅度大于曲唑組(P ＜0.05)，見圖 1、表 2。

3 討論

近年來子宮內(nèi)膜癌的內(nèi)分泌治療受到了廣泛關(guān)注。子宮內(nèi)膜增生從輕度增生、囊腺型增生、腺瘤型增生、不典型增生、原位癌、浸潤癌是一連續(xù)漸進的過程［10］。目前學者們認為大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌屬于雌激素依賴型，其發(fā)生、發(fā)展過程與長期雌激素刺激而無孕激素拮抗相關(guān)［1］。PI3K/Akt/mTOR信號通路與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在此通路中，PTEN抑制PIP2向PIP3轉(zhuǎn)化，進而抑制Akt和mTOR活化，對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行負性調(diào)節(jié)。有研究表明［9］，在增生期上皮和間質(zhì)細胞中PTEN表達增高，而在分泌期腺上皮PTEN的表達有所降低。表明在高濃度雌激素刺激下，PTEN表達增強，若是PTEN發(fā)生突變?nèi)笔?，失去其作用，在高雌激素的刺激下子宮內(nèi)膜更易發(fā)生異常增殖。PTEN基因在子宮內(nèi)膜癌中的突變率為32% ～83%，PTEN基因在子宮內(nèi)膜癌機制中起著非常重要的作用［11～13］。

圖1 各組干預24 h后PTEN、4E-BP1蛋白表達

表2 各組干預24 h PTEN、4E-BP1蛋白表達量比較(n=3，±s)

表2 各組干預24 h PTEN、4E-BP1蛋白表達量比較(n=3，±s)

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依維莫斯是mTOR信號通路抑制劑，通過與細胞內(nèi)FKBP12蛋白形成復合物再與mTORC1結(jié)合并抑制其活性，阻止磷酸化下游的4E-BP1，影響細胞的生長和增殖。來曲唑是非甾體類芳香化酶抑制劑，能顯著抑制腺體外來源的雌激素合成，阻斷雌激素所致的腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用來曲唑后Ishikawa細胞生長明顯受到抑制，增殖能力下降，并呈現(xiàn)一定時效關(guān)系;聯(lián)合組對細胞的生長抑制、誘導凋亡作用要顯著優(yōu)于來曲唑組，表明來曲唑與依維莫斯具有協(xié)同效應(yīng)。本研究顯示應(yīng)用來曲唑后PTEN蛋白的表達增加，4E-BP1蛋白的表達下降，表明來曲唑可抑制細胞中PTEN基因的突變、缺失，使抑癌基因PTEN的表達增多，從而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，致使下游的4E-BP1的表達減少，抑制腫瘤細胞增殖。依維莫斯可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，來曲唑聯(lián)合依維莫斯應(yīng)用，mTOR信號通路下游的4E-BP1的表達較單獨應(yīng)用來曲唑明顯減少，表明來曲唑聯(lián)合依維莫斯應(yīng)用，通過抑制PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號通路，對腫瘤細胞的抑制作用更明顯。

目前化療是晚期或復發(fā)子宮內(nèi)膜癌的綜合治療措施之一，但現(xiàn)有化療藥物對子宮內(nèi)膜癌的療效并不顯著，晚期患者預后較差［16］。因此，研究和開發(fā)新的化療藥物對于晚期或復發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者的治療有著重要意義。本研究結(jié)果顯示，來曲唑聯(lián)合依維莫斯通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號通路，可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖，促進其凋亡，為子宮內(nèi)膜癌臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

［1］Ferguson G，Herzog T.Current research on the use of hormonal therapy in the treatment of advanced or recurrent endometrial cancel［J］.Women＇s OncoI Rev，2004，33(4):175-180.

［2］Quinn MA.Hormonal treatment of endometrial callcer［J］.Hematol Oncol Clin North Am，1999，23(3):163-187..

［3］Martin JL，Baxter RC.Expression of insulin-like growth factor binding protein-2 by MCF-7 breast cancer cells is regulated through the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/mammalian target of rapamycin pathway［J］.Endocrinology，2007，148(5):232-241.

［4］Robrts LR，Gores GJ.Hepatocellular carcinoma:molecular pathway and new therapeutic targets［J］.Semin Liver Dis，2005，25(2):212-225.

［5］Burchet A，Wang Y，Cai D，et al.Compensatory PI3-kinase/AKT/mtor activation regulates imatinib resistance development［J］.Leukemia，2005，19(10):1774-1782.

［6］Bessard A，F(xiàn)remin C，Ezan F，et al.MEK/ERK-dependent uPAR expression is required for motility via phosphorylation of P70S6K in human hepatocarcinoma cells［J］.J Cell Physiol，2007，212(2):526-536.

［7］Chow S，Minden MD，Hedley DW.Constitutive phosphorylation of the S6 ribosomal protein via mTOR and ERK signaling in the peripheral blasts of acute leukemia patients ［J］.Exp Hematol，2006，34(9):1183-1191.

［8］Mutter GL，Lin MC，F(xiàn)itzgerald JT，et al.Altered PTEN expression as a diagnostic marker for the earlist endometrial precancers［J］.J Natl Cancer Inst，2000，92(11):861-863.

［9］Mutter GL，Lin MC，F(xiàn) itzgerald JT，et al.Changes in endometrial PTEN expression throughout the human menstrual cycle［J］.J Clin Endocrinol Metab，2000，85(8):2334-2338.

［10］陳忠年，杜心谷，劉伯寧.婦產(chǎn)科病理學［M］.上海:上海醫(yī)科大學出版社，1996:1491.

［11］Liaw D，Marsh DJ，Li J，et al.Germline mutations of the PTEN gene in Cowden disease，an inherited breast and thyroid cancer syndrome［J］.Nat Genet，1997，16(4):64-67.

［12］Marsh DJ，Kum JB，Lunetta KL，et al.PTEN mutataion spectrum and genotypephenotype correlations in Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome suggest a single entity with Cowden syndrome［J］.Hum Mol Genet，1999，8(2):1461-1472.

［13］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60(5):277-300.