黃芩苷對(duì)人肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

韋小白董競(jìng)成

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院，上海，200040；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海，200040）

黃芩苷對(duì)人肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

韋小白1董競(jìng)成2

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院，上海，200040；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海，200040）

目的：研究觀察黃芩苷對(duì)人肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞株體外的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法：采用不同濃度的黃芩苷干預(yù)人肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞株，用CCK-8方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度的黃芩苷對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制程度，接著用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell小室侵襲試驗(yàn)觀察黃芩苷對(duì)肺癌細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響；用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷干預(yù)后肺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TGF-β的表達(dá)的變化。結(jié)果：黃芩苷能明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖；能不同程度降低肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、體外劃痕愈合能力，呈濃度依賴性；黃芩苷能不同程度下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)，其中以高濃度效果明顯，中濃度居中，低濃度作用稍弱，與空白對(duì)照組比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；對(duì)肺癌細(xì)胞TGF-β的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，與對(duì)照組比較，P＞0.05。結(jié)論：黃芩苷能不同程度地降低肺癌增殖遷移侵襲的能力，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)從而對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲發(fā)揮抑制作用。

黃芩苷；增值；遷移；LTEP-A2細(xì)胞；MMP-2；MMP-9

黃芩苷（Baicalin）是從唇形科植物黃芩中提取、分離出來(lái)的黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一，具有多種藥理作用，如：抗菌、抗氧化、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等[1-3]。近年來(lái)，隨著對(duì)黃芩苷的深入研究，發(fā)現(xiàn)黃芩苷還能夠抑制黏液表皮樣癌腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有顯著的抗腫瘤作用[4]。目前，對(duì)黃芩苷抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在人前列腺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等惡性腫瘤[5-6]，但是關(guān)于黃芩苷作用于肺癌細(xì)胞株的研究較少，如僅有少量報(bào)道黃芩提取物能夠誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與黃芩提取物能上調(diào)caspase -3表達(dá)和下調(diào)survivin基因表達(dá)有關(guān)[7]。既然黃芩苷對(duì)肺癌細(xì)胞株SPC-A-1有作用，那么對(duì)肺癌細(xì)胞株LTEP-A2又有著怎樣的作用？除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，黃芩苷是否還可通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用，目前仍不是十分清楚。為了進(jìn)一步明確黃芩苷的抗腫瘤作用，本研究觀察其對(duì)LTEP-A2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，并進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制的初步探討，以期為臨床應(yīng)用黃芩苷治療肺癌提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

人肺癌細(xì)胞株LTEP-A2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。藥物黃芩苷購(gòu)自南京青澤醫(yī)藥公司，純度：99.1%。小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；CCK8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；β-actin抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；MMP-2、MMP-9、TGF-β抗體為Cell signaling technology公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)共分為4組，分別為50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黃芩苷組，空白對(duì)照組加等量0.5%二甲基亞砜（DMSO）。

1.1 CCK-8法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1×105／mL接種于96孔板內(nèi)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度黃芩苷，總體積100μL，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入CCK -8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。增殖抑制率計(jì)算公式：增殖抑制率（%）＝（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）／A對(duì)照組×100%。

1.2 Transwell小室侵襲試驗(yàn) 采用24孔板Transwell小室進(jìn)行，包被有膠原基質(zhì)的Matrigel濾膜孔徑為8 μm。分別將50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黃芩苷處理的肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105個(gè)／孔接種于上層小室，下層小室加入10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液，37℃孵育24 h，取出濾膜，用棉拭子輕輕擦掉濾膜上層的細(xì)胞，將濾膜用PBS淋洗，固定、染色（參照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相關(guān)步驟），置于甲醇固定10 min，高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移至濾膜下層的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞的數(shù)量／對(duì)照組侵襲細(xì)胞的數(shù)量）× 100%。

1.3 Transwell小室細(xì)胞遷移試驗(yàn) 將Fibronectin 200倍稀釋至終濃度50μg／mL，在Transwell小室內(nèi)加入100μL，小室外加入400μL，4℃過(guò)夜。準(zhǔn)備受試細(xì)胞懸液：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，無(wú)鈣磷的PBS液沖洗，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含1%FBS細(xì)胞培養(yǎng)液收集和重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL。吸取transwell中Fibronectin，PBS沖洗一次。將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加入400μL含10%FBS完全培養(yǎng)液，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育6 h，PBS漂洗3次，4%PAF固定30 min，PBS漂洗3次，Cooomassieblue室溫染色適當(dāng)時(shí)間。倒置顯微鏡下1×10物鏡計(jì)數(shù)貼附于小室多孔膜上的總細(xì)胞數(shù)（No），棉簽擦去小室多孔膜上方細(xì)胞，計(jì)數(shù)殘留在小室多孔膜下方的細(xì)胞數(shù)（N1）。按以下公式計(jì)算細(xì)胞遷移率：細(xì)胞遷移率＝N1／No×100%。每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

1.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 將肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞株傳代于玻片上，生長(zhǎng)至100%匯合后，用無(wú)菌吸頭在玻片上劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈被刮下的細(xì)胞，每孔加纖連蛋白后分別加入50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黃芩苷，對(duì)照組加等量0.5%二甲基亞砜（DMSO），孵育96 h，取出玻片，低倍視野下觀察細(xì)胞傷口愈合情況。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此表示細(xì)胞的遷移活性。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。計(jì)算：細(xì)胞遷移抑制率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)／對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè) 收集50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黃芩苷處理96 h的LTEP-A2細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌，加入5倍體積含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r／min離心15 min，棄去沉淀，上清液為細(xì)胞總蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白含量。100℃變性10 min，每孔加等量的蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別加入兔抗人MMP-2、MMP-9、TGF-β抗體，4℃孵育過(guò)夜。以TBS漂洗5 min×3次，加入羊抗兔HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h后TBS漂洗5 min×3次，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)后分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞體外增殖的影響（*提示P＜0.05）

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞增殖抑制作用

CCK-8方法檢測(cè)黃芩苷對(duì)LTEP-A2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的黃芩苷對(duì)肺癌細(xì)胞有著不同程度的抑制作用，其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之。隨著時(shí)間的推移，不同濃度的黃芩苷作用于肺癌細(xì)胞24 h后開始顯示出抑制作用，48 h后作用顯著，96 h后達(dá)到高峰，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（如圖1）。

2.2 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞遷移作用的影響 將不同濃度的黃芩苷預(yù)處理96 h后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌細(xì)胞的體外愈合能力，其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（如圖2、圖3）。

圖2 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞體外劃痕試驗(yàn)的影響

圖3 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞體外劃痕試驗(yàn)影響統(tǒng)計(jì)圖（*P＜0.05）

2.3 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞侵襲作用的影響 將不同濃度的黃芩苷預(yù)處理96 h后進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖所示：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌細(xì)胞的侵襲能力，其中以其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）次之，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（如圖4）。

2.4 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞MMP-2、MMP -9、TGF-β蛋白表達(dá)的影響 將不同濃度的黃芩苷預(yù)處理96 h后進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。結(jié)果表明：三種不同濃度的黃芩苷能不同程度的下調(diào)LTEP-A2肺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)，其中以其中高濃度組（200μmol／L）的抑制作用最明顯，中濃度組（100 μmol／L）的抑制作用居中，低濃度組（50μmol／L）稍弱，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。而黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，與對(duì)照組比較，P＞0.05（如圖5、圖6）。

圖4 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

圖5 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞MMP-2，MMP-9的影響

圖6 黃芩苷對(duì)肺腺癌LTEP-A2細(xì)胞TGF-β的影響

3 討論

肺腺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，肺腺癌死亡居惡性腫瘤首位[8]。由于肺腺癌細(xì)胞具有快速侵襲、遷移的特征，因此它是肺癌預(yù)后最差的病理類型之一[9-10]。因此，如何有效抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，是改善預(yù)后、控制病情進(jìn)展的關(guān)鍵。

黃芩性寒、味苦，歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。主治壯熱煩渴，肺熱咳嗽，黃疸，目赤腫痛，胎動(dòng)不安，癰腫療瘡等。關(guān)于黃芩可治腫瘤的功效，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就載黃芩具有“主諸熱黃疸，腸癖泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”的功效。而黃芩苷為傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分之一，目前研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)多種腫瘤均有較好的作用。如王英俊等[6]用不同濃度的黃芩苷處理結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-1116后，發(fā)現(xiàn)50，100，200μmol／L黃芩苷能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-1116凋亡，凋亡率與劑量呈正相關(guān)，并隨藥物濃度和作用時(shí)間而變化。細(xì)胞周期分布呈現(xiàn)G1期比例逐漸增高，出現(xiàn)典型的凋亡峰。說(shuō)明黃芩苷能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并明顯抑制癌細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤作用?，F(xiàn)有研究表明黃芩苷可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制腫瘤新生血管生成從而降低腫瘤細(xì)胞的增值遷移[11]，如通過(guò)降低環(huán)氧化酶-2的表達(dá)抑制前列腺素E2的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷前列腺素合成酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用[12]。而關(guān)于黃芩苷對(duì)于肺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用及機(jī)制研究，目前缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷對(duì)LTEPA2細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。同時(shí)，經(jīng)過(guò)黃芩苷的干預(yù)后，肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力與對(duì)照組比較都有不同程度的降低。且這種抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，這和已有報(bào)道黃芩苷能抑制人肝癌細(xì)胞的侵襲能力[13]一致。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對(duì)基底膜中細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要步驟之一[14-15]。MMPs家族是一類內(nèi)源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9是該家族的重要成員，這兩種酶的主要功能為降解明膠和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜膠原，在細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附中起著重要的作用，MMP-2、MMP-9的表達(dá)與腫瘤侵襲關(guān)系密切。有研究顯示，在肺癌細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9高表達(dá)可促進(jìn)該腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[16]。

TGF-β在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中均有表達(dá)，是預(yù)測(cè)相關(guān)腫瘤的易感性及腫瘤預(yù)后的重要細(xì)胞因子[17-21]。有研究表明，TGF-β可促進(jìn)前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。既然MMPs和TGF -β在肺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中如此重要，而黃芩苷能顯著抑制肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，那么用黃芩苷干預(yù)后這些細(xì)胞因子是否也發(fā)生改變？本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，黃芩苷組的MMP-2、MMP-9的表達(dá)下降，TGF-β表達(dá)不變。為了進(jìn)一步驗(yàn)證黃芩苷與MMP-2、MMP-9與TGF-β的關(guān)系，我們分別用不同濃度的黃芩苷干預(yù)肺癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的黃芩苷組MMP-2、MMP-9表達(dá)最低，低濃度組較高濃度組表達(dá)高，中濃度組居中，而不同濃度的黃芩苷對(duì)TGF-β表達(dá)沒(méi)有影響。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能不同程度地降低肺癌增殖遷移侵襲的能力，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)從而對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲發(fā)揮抑制作用。

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（2013-10-10收稿 責(zé)任編輯：王明）

Study on Inhibition Effect and Mechanism of Baicalin on LTEP-A2 Cells in Lung Cancer Patients

Wei Xiaobai1，Dong Jingcheng2
（1 Jingan Branch of Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China；2 Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China）

Objective：To explore the inhibition effects and mechanism of baicalin on LTEP-A2 cells in vitro of lung cancer patients.Methods：Human pneumonicadenocarcinoma cell line LTEP-A2 was cultured with different dose of baicalin for different periods of time. Cell proliferation was assayed by using Cell Counting Kit-8，and further in vitro study including tumor cell migration and invasion，wound healing assays were performed.Besides，MMP-2，MMP-9，TGF-β，which were related to the migration and metastasis potential in lung cancer cell lines were detected by western blot.Results：Baicalin inhibited the proliferation of LTEP-A2 cells in a time and concentrationdependent manner.In tumor cell migration and invasion test，wound healing assays etc.showed significantly decreased migration，invasion in baicalin-treated cell groups vs control tumor cells.Further study showed that MMPs decreased after baicalin-treated.The higher doses of baicalin，the lower level of MMP-2／MMP-9.However，baicalin did not have a significant effect on the TGF-β.Conclusion：Baicalin inhibits the proliferation and migration of lung cancer LTEP-A2 cells，possibly by decreasing the expression of MMP-2，MMP-9 in part.

Baicalin；Proliferation；Metastasis；LTEP-A2 cells；MMP-2；MMP-9

R285.5；R734.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.025

董競(jìng)成（1959—），男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，E-mail：jcdong2004＠126.com

韋小白（1981—），女，博士，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院，E-mail：weixiaobai2005＠163.com