竹筍多糖對(duì)中華絨螯蟹免疫調(diào)節(jié)作用的研究

■李 義 俞泉宇 陳亞軍 何沅濱

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123)

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國(guó)主要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。近年來(lái)，隨著其規(guī)模化和集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高，病害日趨嚴(yán)重，時(shí)常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，在蟹病防治中仍然主要依靠水體消毒劑和內(nèi)服抗菌藥物，然而殺菌劑與抗生素的大量使用會(huì)帶來(lái)水體污染、耐藥性和藥物殘留等一系列問(wèn)題。因此，尋求高效、環(huán)保、低毒副作用的藥物，例如研發(fā)免疫增強(qiáng)劑，有效提高蟹體自身的免疫力與抗病力，已成為中華絨螯蟹飼料添加劑與病害免疫防治研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)課題。研究表明，竹筍多糖（Bamboo Shoots Polysaccharide,BSP）具有抗氧化、抗補(bǔ)體及抗腫瘤作用，能提高健康，提高由環(huán)磷酰胺所致免疫抑制中華絨螯蟹的部分非特異性免疫指標(biāo)活性。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)體腔注射一定劑量的BSP，考察BSP對(duì)中華絨螯蟹的一些主要免疫指標(biāo)的影響，以期進(jìn)一步驗(yàn)證BSP對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為開(kāi)發(fā)適合中華絨螯蟹的綠色、無(wú)毒的BSP免疫增強(qiáng)劑與飼料添加劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

試驗(yàn)選擇健康中華絨螯蟹300只，平均體質(zhì)量為（23.86±0.37）g。BSP（多糖含量為65.3%）為本實(shí)驗(yàn)室自制；多聚-L-賴(lài)氨酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）為Sigma產(chǎn)品；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）凍干粉由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）CL99920菌株為浙江淡水水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)；超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和添加1、5、10、20 mg/kg BSP組5個(gè)處理組，每處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)蟹經(jīng)過(guò)1周暫養(yǎng)后，挑選規(guī)格整齊、健康的個(gè)體稱(chēng)重后隨機(jī)分組飼養(yǎng)于15個(gè)直徑70 cm、高100 cm和水深45 cm的圓形玻璃鋼桶內(nèi)，每桶放養(yǎng)20只蟹。所有養(yǎng)殖桶均連接成一個(gè)自動(dòng)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，每天早晚各投喂基礎(chǔ)飼料（不含BSP）1次，投喂至飽食狀態(tài)。試驗(yàn)期水溫控制在（27±1.5）℃，并用增氧泵連續(xù)增氧。在注射竹筍多糖或生理鹽水后第1、4、7和10 d，在5個(gè)處理組的每一重復(fù)中隨機(jī)采取3只中華絨螯蟹，采集血淋巴液，制成抗凝血與血清備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 免疫指標(biāo)的測(cè)定

采樣測(cè)定血細(xì)胞總數(shù)（Total haemocyte count,THC）、吞噬百分率（Phagocytic percentage,PP)、吞噬指數(shù)（Phagocytic index,PI）、呼吸爆發(fā)（Respiratory burst,RB）活性，血清溶菌酶（Lysozyme,LSZ）活性及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。THC、PP及PI的測(cè)定參照朱忠勇(1997)的方法適當(dāng)修改后進(jìn)行，PP為100個(gè)血細(xì)胞中吞噬有細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/100×100%，PI為100個(gè)參與吞噬的血細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/100；RB活性的測(cè)定參照Song等(1994)的NBT還原法適當(dāng)修改后進(jìn)行；LSZ活性的測(cè)定參照Hultmark等(1980)的方法適當(dāng)修改后進(jìn)行；SOD活性按試劑盒的要求進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 抗病力（免疫保護(hù)率）的測(cè)定

在注射BSP后的第4 d，從每個(gè)處理組中取蟹6只（每一重復(fù)組中取蟹2只，然后集中放養(yǎng)在一起），以1.2×107cfu/kg體質(zhì)量的劑量體腔注射接種中華絨螯蟹致病菌嗜水氣單胞菌CL99920菌株菌懸液，每天投喂基礎(chǔ)飼料至飽食狀態(tài)，控制水溫在25℃左右，并按常規(guī)進(jìn)行管理，記錄接種7 d后各組蟹的累積死亡率，計(jì)算抗病力（免疫保護(hù)率）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)值用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示，采用SPSS（17.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并用Duncan's檢驗(yàn)法進(jìn)行均值間多重比較。P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSP對(duì)中華絨螯蟹THC的影響（見(jiàn)表1）

表1 BSP對(duì)中華絨螯蟹THC的影響（×106個(gè)/ml）

由表1可知，第1 d，10 mg/kg組的THC顯著高于對(duì)照組和其他3個(gè)試驗(yàn)組（P＜0.05）；第4 d，1、5和10 mg/kg組的THC顯著高于對(duì)照組和20 mg/kg組，5 mg/kg組顯著高于10 mg/kg組（P＜0.05）；第7 d，4個(gè)試驗(yàn)組的THC均顯著高于對(duì)照組，10 mg/kg組顯著高于1、5和20 mg/kg組，20 mg/kg組顯著高于1、5 mg/kg組，5 mg/kg組顯著高于1 mg/kg組（P＜0.05）；第10 d，5個(gè)處理組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由表1還可以看出，4個(gè)試驗(yàn)組的THC均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在第7 d達(dá)到最大值，第10 d恢復(fù)至對(duì)照組水平；第7 d各試驗(yàn)組的THC均顯著高于第1、4和10 d（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)劑量的BSP均可使中華絨螯蟹的THC明顯增加，從整體上看，以10 mg/kg劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹THC的提升效果較好。

2.2 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PP的影響（見(jiàn)表2）

表2 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PP的影響（%）

由表2可知，第4 d，4個(gè)試驗(yàn)組的血細(xì)胞PP均顯著高于對(duì)照組，5 mg/kg組顯著高于1、10和20 mg/kg組（P＜0.05）；第1、7和10 d，5個(gè)處理組的血細(xì)胞PP均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由表2還可以看出，4個(gè)試驗(yàn)組的血細(xì)胞PP均在第4 d達(dá)到最大值，第7 d恢復(fù)至對(duì)照組水平并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束的第10 d；第4 d各試驗(yàn)組的血細(xì)胞PP均顯著高于第1、7和10 d（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)劑量的BSP能不同程度地提高中華絨螯蟹血細(xì)胞的PP，從整體上看，以5、10 mg/kg劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PP的提升效果較好。

2.3 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PI的影響（見(jiàn)表3）

表3 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PI的影響

由表3可知，第4 d，4個(gè)試驗(yàn)組的血細(xì)胞PI均顯著高于對(duì)照組，5、10 mg/kg組顯著高于1 mg/kg組（P＜0.05）；第7 d，5、10和20 mg/kg組的血細(xì)胞PI顯著高于對(duì)照組，5 mg/kg組也顯著高于1、10 mg/kg組（P＜0.05）；第 1、10 d，5個(gè)處理組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由表3還可以看出，1、10 mg/kg組第4 d的血細(xì)胞PI顯著高于第1、7和10 d（P＜0.05）；5 mg/kg組第4、7 d的血細(xì)胞PI顯著高于第1、10 d，第4 d顯著高于第7 d（P＜0.05）；20 mg/kg組第4 d的血細(xì)胞PI顯著高于第1、7和10 d，第7 d又顯著高于第10 d（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PI均有較好的提升效果，均在注射多糖后第4 d達(dá)到最高值并于第10 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平；從整體上看，以5、10 mg/kg劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞PI的提升效果較好。

2.4 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞RB活性的影響(見(jiàn)表4)

表4 BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞RB活性的影響（OD630 nm值）

由表4可知，在整個(gè)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞RB活性均沒(méi)有顯著的影響（P＞0.05）。

2.5 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性的影響（見(jiàn)表5）

表5 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性的影響（U）

由表5可知，第1 d，4個(gè)試驗(yàn)組的血清LSZ活性均顯著高于對(duì)照組，1 mg/kg組也顯著高于5、20 mg/kg組（P＜0.05）；第4、7和10 d，5個(gè)處理組的血清LSZ活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由表5還可以看出，試驗(yàn)組第1 d的血清LSZ活性均顯著高于第4、7和10 d（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性均有一定的提升效果，以1、10 mg/kg劑量的BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性的提升效果較好。

2.6 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清SOD活性的影響(見(jiàn)表6)

表6 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清SOD活性的影響（NU/ml）

由表6可知，第1 d，5個(gè)處理組的血清SOD活性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；第4、7和10 d，4個(gè)試驗(yàn)組的血清SOD活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。第4 d，1 mg/kg組顯著高于5、10 mg/kg組（P＜0.05）；第7 d，5、10 mg/kg組顯著高于1、20 mg/kg組，1 mg/kg又顯著高于20 mg/kg組（P＜0.05）；第10 d，1 mg/kg組顯著高于其它各試驗(yàn)組，5、10 mg/kg組又顯著高于20 mg/kg組（P＜0.05）。由表6還可以看出，1、20 mg/kg組第4 d的血清SOD活性最高，分別顯著高于第1、7 d和1、7、10 d；5、10 mg/kg組第7 d的血清SOD活性最高，分別顯著高于第1、4、10 d 和1、10 d。以上結(jié)果表明，注射試驗(yàn)劑量尤其是1～10 mg/kg的BSP能顯著提高中華絨螯蟹血清SOD活性。

2.7 BSP對(duì)中華絨螯蟹抗病力（免疫保護(hù)率）的影響（見(jiàn)表7）

表7 BSP對(duì)中華絨螯蟹抗病力（免疫保護(hù)率）的影響

由表7可知，采用致病性嗜水性氣單胞菌攻毒后7 d，對(duì)照組的累積死亡率達(dá)100%，而4個(gè)試驗(yàn)組的累積死亡率均低于對(duì)照組。由此表明，注射試驗(yàn)劑量的BSP可不同程度地增強(qiáng)中華絨螯蟹對(duì)致病性嗜水性單胞菌感染的抵抗力，以10 mg/kg組的免疫保護(hù)率最高（83.33%）。

3 討論

3.1 BSP對(duì)中華絨螯蟹THC及吞噬功能的影響

研究表明，甲殼動(dòng)物缺乏特異性免疫，血細(xì)胞在非特異性免疫防御反應(yīng)中起著主要作用。THC的高低在一定程度上能體現(xiàn)抵抗病原體入侵能力的強(qiáng)弱。血細(xì)胞的吞噬作用及吞噬過(guò)程中因呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生的活性氧在殺菌活性中起著重要作用。因此，測(cè)定THC、血細(xì)胞的PP、PI和RB活性，能較好地評(píng)價(jià)BSP對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞免疫功能的影響。

Tania等（2008）發(fā)現(xiàn)，對(duì)南方濱對(duì)蝦注射2.11、4.36 mg/kg的大腸桿菌脂多糖，試驗(yàn)蝦的THC明顯增加。Wang等的研究表明，在注射6 μg/g的幾丁質(zhì)和2、4 μg/g的殼聚糖后2 d，凡納濱對(duì)蝦的THC顯著增加。王雪良發(fā)現(xiàn)，在對(duì)中華絨螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后第1 d，試驗(yàn)蟹的THC顯著地高于注射生理鹽水組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)劑量的BSP能明顯提高中華絨螯蟹的THC，以10 mg/kg的提升效果較好。這與上述研究的結(jié)果基本一致。

Cheng等(2004)的研究表明，注射50 μg/g的海藻酸鈉后1、2、4 d，凡納濱對(duì)蝦的吞噬活性顯著上升。王海麗等(2011)發(fā)現(xiàn)，注射南極寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌ANT52的脂多糖后第3、6 d，2、4 mg/kg兩個(gè)劑量組的梭子蟹血細(xì)胞PP和PI均顯著高于對(duì)照組。王雪良(2008)發(fā)現(xiàn)，對(duì)中華絨螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后1、3 d，血細(xì)胞的PP和PI較注射生理鹽水組顯著增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在對(duì)中華絨螯蟹注射1、5、10和20 mg/kg的BSP后第4 d，各試驗(yàn)組的血細(xì)胞PP和PI均顯著高于對(duì)照組，以5、10 mg/kg的效果較好。這與上述研究的結(jié)果基本一致。

Cheng等(2004)發(fā)現(xiàn)，對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射20 μg/g的海藻酸鈉后1 d，對(duì)蝦的RB活性顯著增加。Wang等(2005)的研究表明，注射2、4 μg/g的殼聚糖、6 μg/g的幾丁質(zhì)后2 d，凡納濱對(duì)蝦的RB活性顯著增加。王雪良(2008)的研究表明，在對(duì)中華絨螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后第3 d，蟹的RB活性（·O2-產(chǎn)量）顯著高于注射生理鹽水組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)中華絨螯蟹注射試驗(yàn)劑量的BSP對(duì)血細(xì)胞RB活性沒(méi)有顯著影響，這與上述研究的結(jié)果不同。這可能與BSP對(duì)·O2-和H2O2具有極強(qiáng)的清除作用有關(guān)，蟹體內(nèi)一旦有過(guò)多的·O2-和H2O2產(chǎn)生，就會(huì)被BSP直接清除一部分，剩余部分則通過(guò)BSP刺激增強(qiáng)的抗氧化機(jī)制（如本研究中SOD活性的增加）來(lái)消除，從而使呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的·O2-始終維持在對(duì)照組水平。

3.2 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性的影響

LSZ廣泛存在于各種動(dòng)植物中，在生物免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。李紅權(quán)等(2008)的研究表明，對(duì)日本囊對(duì)蝦注射灰樹(shù)花多糖后72、96 h，試驗(yàn)組的血清LSZ活性顯著高于對(duì)照組。楊季芳等(2011)對(duì)三疣梭子蟹注射從南極海洋寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌中提取的脂多糖，第3、6 d，試驗(yàn)組的血清LSZ活性顯著高于對(duì)照組。王雪良(2008)發(fā)現(xiàn)，以2 mg/kg的酵母 β-1,3/1,6-葡聚糖對(duì)中華絨螯蟹進(jìn)行體腔注射，能顯著地增加試驗(yàn)蟹的血清LSZ活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)中華絨螯蟹注射1、5、10和20 mg/kg的BSP后第1 d，各試驗(yàn)組的血清LSZ活性均顯著高于對(duì)照組，以1 mg/kg組的活性最高，第4 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究的結(jié)果類(lèi)似，但BSP對(duì)中華絨螯蟹血清LSZ活性的增加作用以低劑量的效果較好且各試驗(yàn)劑量引起的免疫效應(yīng)持續(xù)的時(shí)間均較短，其原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 BSP對(duì)中華絨螯蟹血清SOD活性的影響

SOD在清除活性氧、防止分子損傷、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要的作用。SOD活性的變化可以作為衡量甲殼動(dòng)物免疫水平的指標(biāo)。王海麗等(2011)研究證實(shí)，注射2、4 mg/kg的南極寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌ANT52脂多糖能顯著提高梭子蟹血清SOD活性，2 mg/kg的效果優(yōu)于4 mg/kg。李紅權(quán)等(2009)的研究表明，注射1%灰樹(shù)花多糖溶液96 h后，日本沼蝦血清SOD活性顯著上升。沈錦玉等(2004)對(duì)中華絨螯蟹注射1%海帶多糖溶液，發(fā)現(xiàn)注射后48 h，蟹血清SOD活性極顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)中華絨螯蟹注射適量的BSP可顯著增強(qiáng)血清SOD活性。這與上述研究的結(jié)果相一致，也與本試驗(yàn)中血細(xì)胞RB活性在整個(gè)試驗(yàn)期無(wú)顯著變化的結(jié)果相一致。Lin等(2008)的試驗(yàn)表明，鋸緣青蟹在注射β-葡聚糖后6～48 h，在注射肽聚糖后6～72 h，血細(xì)胞中的胞外銅鋅超氧化物歧化酶（ecCuZnSOD）基因轉(zhuǎn)錄量顯著增加。為此推測(cè)注射BSP刺激中華絨螯蟹SOD活性顯著增加的分子機(jī)制有可能也是使SOD的基因表達(dá)量顯著增加所致，是否如此，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.4 BSP對(duì)中華絨螯蟹抗病力的影響

研究表明，注射6 μg/g的幾丁質(zhì)和4 μg/g的殼聚糖、注射10 μg/g的海藻酸鈉能明顯增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦對(duì)溶藻弧菌的抵抗力；注射β-1,3/1,6-葡聚糖、海帶多糖、米糠多糖或山藥多糖、海藻酸鈉或殼聚糖，均能增強(qiáng)中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌感染的抵抗力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，注射BSP也能明顯增強(qiáng)試驗(yàn)蟹對(duì)嗜水氣單胞菌感染的抵抗力，這與上述研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)中華絨螯蟹體腔注射適量的竹筍多糖在一定時(shí)間內(nèi)能顯著地提高其THC、血細(xì)胞PP及PI，顯著地增強(qiáng)其血清LSZ與SOD活性，并能不同程度地增強(qiáng)中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌感染的抵抗力，以10 mg/kg體質(zhì)量劑量的效果較好。由此表明，竹筍多糖能調(diào)節(jié)中華絨螯蟹的免疫機(jī)能，可作為中華絨螯蟹潛在的免疫增強(qiáng)劑和飼料添加劑。

（參考文獻(xiàn)24篇，刊略，需者可函索）