酪氨酸酶活性與黑素生成關(guān)系的基礎(chǔ)及臨床研究

聞人慶 陸偉宏 嚴(yán)春霞 張鴻鳴 綜述，何國(guó)產(chǎn) 審校

（金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室浙江金華321007）

酪氨酸酶活性與黑素生成關(guān)系的基礎(chǔ)及臨床研究

Basic and clinical research of the relationship between the activity of tyrosinase and the synthesis of melanin

聞人慶 陸偉宏 嚴(yán)春霞 張鴻鳴 綜述，何國(guó)產(chǎn) 審校

（金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室浙江金華321007）

黑素細(xì)胞是產(chǎn)生黑素的高度特異性細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的高爾基體可合成黑素小體，為黑素合成的場(chǎng)所。樹(shù)突是黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)的重要特征性標(biāo)志，在黑素轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用。它形成樹(shù)枝狀分叉，朝鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)，促使黑素細(xì)胞將黑素輸送給它們，增加機(jī)體色素沉著[1]。黑素是一種化學(xué)本質(zhì)為蛋白衍生物的無(wú)定形小顆粒，廣泛存在于人的皮膚、毛發(fā)和眼球組織中，決定著相應(yīng)部位的顏色。并吸收陽(yáng)光中的紫外線，保護(hù)皮膚不受陽(yáng)光照射的傷害,因此,又稱作光防護(hù)色素。可分為真黑素（eumelanin）和褐黑素（pheomelanin）兩類，前者在黑色毛發(fā)中大量存在，后者在褐色及紅色毛發(fā)中比率相對(duì)較高。黑素生成異常與黃褐斑、白化病等色素障礙性疾病關(guān)系密切，伴隨著人們對(duì)自身形象越來(lái)越高的追求，對(duì)黑素的相關(guān)研究日益成為醫(yī)學(xué)美容界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。本文就酪氨酸酶的活性與黑素生成關(guān)系的基礎(chǔ)及研究綜述如下。

1 酪氨酸酶基因家族、酪氨酸酶及黑素的生成

1.1 酪氨酸酶基因家族與酪氨酸酶：酪氨酸酶基因家族成員包括酪氨酸酶基因（TYR基因）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因（TYRP1基因）和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2基因（TYRP2基因）等。它們的序列具有高度一致性，共同作用于黑素細(xì)胞，調(diào)節(jié)黑素生成的種類和數(shù)量。

核心成員TYR基因在人類定位于11q14-q21,長(zhǎng)度超過(guò)65kb,包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，是眼皮膚白化?、裥停∣CA1）的致病基因。其第一外顯子最長(zhǎng),幾乎占了全部編碼序列的一半?；蛏嫌未嬖谥鳷ATA、CAAT盒等調(diào)控序列。在11p11至著絲粒區(qū)域,存在著一個(gè)TYR基因的相關(guān)序列，是第四和第五外顯子的同源序列,同源性高達(dá)97%[2]。其編碼的酪氨酸酶是由529個(gè)氨基酸殘基組成的黑素小體跨膜酶蛋白,分子量為55KD,糖基化后分子量為65～75KD。包括CuA和CuB這兩個(gè)銅原子結(jié)合位點(diǎn)、由18個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽及C末端疏水的跨膜區(qū)[3]。

TYRP1基因在人類定位于9p23，是眼皮膚白化病Ⅲ型（OCA3）的致病基因。該病患者的黑素并不會(huì)完全缺失，但在數(shù)量和類型上發(fā)生了改變。其編碼的酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1（TYRP1）是由537個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作用與酪氨酸酶相似但活性較弱[4]。酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2 (TYRP2)與TYRP1在一級(jí)結(jié)構(gòu)上非常相似,折疊后亦形成相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2 黑素的生成：黑素的生成是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程,酪氨酸酶在其中發(fā)揮酪氨酸羥化酶、多巴氧化酶和5，6二羥基吲哚氧化酶的作用。首先，酪氨酸在酪氨酸酶的催化下生成多巴（DOPA），該反應(yīng)即為黑素合成過(guò)程中限速步驟。依舊在酪氨酸酶的催化下，多巴氧化為多巴醌（DQ），后者經(jīng)過(guò)多聚化反應(yīng)生成無(wú)色多巴色素。無(wú)色多巴色素極不穩(wěn)定，可被另一分子多巴醌迅速氧化成多巴色素。而后多巴色素在TYRP2的作用下可以羥化為5，6二羥基吲哚羧酸（DHICA），也可以脫羧為5，6二羥基吲哚（DHI）。5，6二羥基吲哚經(jīng)由酪氨酸酶催化氧化為5，6-吲哚醌，為真黑素形成的前體。由5，6二羥基吲哚轉(zhuǎn)化來(lái)的真黑素為黑色的，由5，6二羥基吲哚羧酸轉(zhuǎn)化而來(lái)的真黑素為棕色，TYRP1活性增強(qiáng)有利于黑色真黑素的生成。真黑素與褐黑素的生成比率則主要與酪氨酸酶活性水平相關(guān),酶活性增高促使真黑素生成增加[3]。

1.3 酪氨酸酶對(duì)于黑素合成的影響：酪氨酸酶靠跨膜肽段固定于黑素小體膜上,影響其在黑素小體膜上的定位及黑素小體腔內(nèi)pH改變等，均可致黑素合成障礙。酪氨酸酶氨基末端的信號(hào)序列對(duì)于其正確定位至關(guān)重要，突變可能導(dǎo)致的信號(hào)肽消失引起酪氨酸酶的錯(cuò)誤折疊并迅速降解。同時(shí)，銅原子和酶蛋白的結(jié)合對(duì)于酶發(fā)揮催化功能也具有非常重要的作用，一個(gè)銅原子與酶的結(jié)合有助于酶與另一個(gè)銅原子的結(jié)合。據(jù)對(duì)眼皮膚白化病的致病突變研究顯示，致病的無(wú)義突變和移碼突變相對(duì)隨機(jī)地分布于酪氨酸酶基因的編碼區(qū),而錯(cuò)義突變的分布則明顯呈現(xiàn)出5個(gè)簇集區(qū)。除CuA、CuB結(jié)合區(qū)外,其他3個(gè)分別位于CuA與氨基末端之間、CuA與CuB之間、CuB與TM區(qū)域之間[5]。據(jù)此推測(cè)致病的錯(cuò)義突變或者影響了酶與Cu原子的結(jié)合，或干擾酶與底物的結(jié)合,從而影響酪氨酸酶活性。有些突變還可能引起酶蛋白生成過(guò)程的分選異常,致使蛋白多肽提前降解,黑素小體內(nèi)的酪氨酸酶活性大幅度降低甚至消失[3]。在非黑素細(xì)胞，通過(guò)增加胞內(nèi)細(xì)胞器的pH值，酪氨酸酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基體進(jìn)行糖化加工，然后由運(yùn)轉(zhuǎn)囊泡攜帶至Ⅱ期黑素體[6]。將正常的和突變的TYR基因在COS-7細(xì)胞中表達(dá),發(fā)現(xiàn)突變后的基因產(chǎn)物并不能象野生型那樣通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移行入黑素小體,而是滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的監(jiān)控機(jī)制對(duì)蛋白質(zhì)的微小異常高度敏感,酪氨酸酶微小的改變都可能導(dǎo)致降解,使酶活性大幅度的降低甚至消失，致黑素的生成障礙[7]。研究表明,至少部分TYR基因的錯(cuò)義突變通過(guò)引起酪氨酸酶的成熟異常使黑素的合成發(fā)生障礙,進(jìn)而引起眼皮膚白化病。還有研究顯示突變的酪氨酸酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與分子伴侶結(jié)合延遲,不能正常折疊因而無(wú)法輸出[8]。

TYRP1對(duì)黑素合成初期的酪氨酸酶發(fā)揮羥化酶和多巴氧化酶活性有明顯的促進(jìn)作用，是決定不同人種黑素生成及分布的重要因素。TYRP2則具有加速黑素生成作用。同時(shí)，酪氨酸酶活性在TYRP1和TYRP2存在時(shí)更加穩(wěn)定，表明兩者對(duì)維持酪氨酸酶在黑素小體膜上的穩(wěn)定具有重要作用。

2 黑素與疾病及美膚

各種因素都可能通過(guò)改變酪氨酸酶活性影響黑素的合成。探究這些影響因素與皮膚等處色素沉著之間的關(guān)系，對(duì)于闡明某些色素障礙性疾病的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防其發(fā)生或開(kāi)展有效的臨床治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。

2.1 黑素生成過(guò)多：在我國(guó)群眾生活水平提高的同時(shí)，越來(lái)越多的人尤其是女性開(kāi)始密切關(guān)注自身皮膚的美白狀況，而皮膚的色素沉著等亞健康狀態(tài)卻始終是困擾著人們的一個(gè)難題。黃褐斑是多發(fā)生于顴頰部的一種色素沉著性疾病，亞洲人發(fā)病率很高，為基底層黑素顆粒增多所致。黑素細(xì)胞痣即日常所說(shuō)的痣、雀斑、老年斑、甚至黑色素細(xì)胞瘤等也都是人體黑素生成過(guò)多的臨床表現(xiàn)。過(guò)量使用激素或長(zhǎng)期接觸重金屬離子可刺激皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子，諸如前列腺素、干細(xì)胞因子、一氧化氮等都可加重皮膚色素沉著[9-11]。此外，勞累、緊張焦慮及睡眠不足時(shí)，垂體分泌大量促黑細(xì)胞激素，增加黑素合成。女性經(jīng)期、妊娠期及某些卵巢性疾病致雌激素分泌增多，酪氨酸酶催化作用增強(qiáng)，也可導(dǎo)致黑素形成增加[12]。

色素沉著的過(guò)程十分復(fù)雜，黑素的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)是最為重要的兩個(gè)環(huán)節(jié)。單位體表面積的黑素細(xì)胞呈對(duì)稱分布，頸部最多，上肢、后背次之，下肢、胸部最少，這一分布特點(diǎn)恰與身體各部位接受紫外線數(shù)量的梯度一致。表明紫外線照射，尤其是中波紫外線(UVB)可以促進(jìn)釋放多種刺激因子，誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分裂增殖，增加黑素生成，并增強(qiáng)黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)。但當(dāng)UVB照射劑量到達(dá)某個(gè)臨界點(diǎn)后，黑素細(xì)胞又隨著照射劑量的增加而迅速降低。同時(shí)光照可致酪氨酸酶基因表達(dá)增加，促成黑素的生成。另一方面，酪氨酸酶的活性亦隨著UVB照射劑量的增加而增強(qiáng),直達(dá)到某一最大照射劑量。此最大照射劑量基本與之前所述的黑素細(xì)胞達(dá)最大數(shù)量時(shí)的UVB照射劑量平行。此后,酶活性將保持高水平但不再增長(zhǎng)。另?yè)?jù)研究表明，對(duì)體外黑素細(xì)胞進(jìn)行熱處理可增加黑素細(xì)胞及酪氨酸酶活性，促進(jìn)黑素合成。證實(shí)了日光中的紅外線及激光治療等產(chǎn)生的熱效應(yīng)對(duì)皮膚亦有類似紫外線的作用[13]。

2.2 黑素生成不足或缺如：酪氨酸酶基因突變所致的OCA1是最常見(jiàn)和表型嚴(yán)重的眼皮膚白化病類型。患者毛發(fā)呈白色或淺黃色,皮膚呈白色且對(duì)紫外線格外敏感易被灼傷,患皮膚癌的可能性較正常人增高。眼黑素缺乏導(dǎo)致嚴(yán)重視力低下,伴屈光不正、畏光和眼球震顫等表現(xiàn)。可分OCA1A和OCA1B兩個(gè)亞型，是同一基因不同突變導(dǎo)致酶蛋白功能異常程度不同的結(jié)果。前者酪氨酸酶完全沒(méi)有活性或根本沒(méi)有酶產(chǎn)生，患者皮膚和毛發(fā)終生呈白色，眼部癥狀也非常嚴(yán)重。后者的基因還能編碼生成有殘存活性的酪氨酸酶,患者毛發(fā)顏色呈淺黃色或黃棕色。皮膚暴露于日光中亦可刺激黑素生成,視力癥狀也可因眼部色素的增加而略有改善[14]。

致病機(jī)制復(fù)雜的白癜風(fēng)臨床研究頗為廣泛，多認(rèn)為是具有遺傳素質(zhì)的個(gè)體在各種內(nèi)外因素的作用下，免疫、精神及神經(jīng)內(nèi)分泌等方面的功能紊亂所致。患者酪氨酸酶系統(tǒng)被抑制或黑素細(xì)胞遭到破壞，黑素生成障礙引發(fā)皮膚色素脫失。

3 酪氨酸酶抑制劑與激活劑的應(yīng)用研究

作為黑素合成過(guò)程中的限速酶，激活或抑制酪氨酸酶的活性即可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)黑素的生成數(shù)量，達(dá)到相應(yīng)的醫(yī)學(xué)及美容用途。

針對(duì)酪氨酸酶活性抑制的研究，在防紫外線輻射及美白化妝品的研發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。過(guò)去幾十年間，大量具有酪氨酸酶抑制活性的化合物相繼被發(fā)現(xiàn)，但只有極少部分的化合物或提取物被成功地應(yīng)用于國(guó)民產(chǎn)業(yè)。其中的大部分由于來(lái)源受限、安全性差或抑制活性弱等原因，并無(wú)實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。目前市場(chǎng)上美白化妝品所采用的增白添加劑，諸如維生素類化合物、苯甲醛類化合物以及植物提取物，無(wú)論是天然提取還是化學(xué)合成的，均為通過(guò)抑制該酶的活性而發(fā)揮作用。傳統(tǒng)的抑制劑因其所固有毒副作用，目前已逐漸被植物提取物所取代，雖然植物提取物有不穩(wěn)定、易失活、不易組合配方及純度不高等缺點(diǎn)。有文獻(xiàn)歸納一些多酚類物質(zhì)，特別是具有2，4-二羥基取代單元的黃酮類和二苯乙烯類化合物具備成為較好的酪氨酸酶抑制劑的條件[15]。部分?？坪投箍祁愔参矬w內(nèi)這類物質(zhì)含量豐富，如何從這些植物中提取低毒、高效的美白活性成分已成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要方向。

同理，酪氨酸酶激活劑能促進(jìn)黑素的合成。相關(guān)研究不僅能為闡明黑素缺失性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論支持，也可為尋找相關(guān)疾病的治療藥物奠定基礎(chǔ)。國(guó)外曾見(jiàn)十二烷基磺酸鈉、苯甲醇和絲氨酸蛋白酶對(duì)酪氨酸酶有激活作用的報(bào)道。國(guó)內(nèi)的研究已證實(shí)從中藥補(bǔ)骨脂中提取得到補(bǔ)骨脂素對(duì)酪氨酸酶有一定的激活作用[16]。中醫(yī)治療白癜風(fēng)的有效方劑滋補(bǔ)肝腎方含藥血清對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性有正向的調(diào)節(jié)作用,并可促進(jìn)TYRP1 mRNA,TYR mRNA及蛋白的表達(dá),這可能是滋補(bǔ)肝腎方臨床治療白癜風(fēng)的機(jī)理之一[17]。王建華等[18]發(fā)現(xiàn)丹參、何首烏等10種中藥對(duì)酪氨酸酶有著不同程度的激活作用，也已將這一研究結(jié)果應(yīng)用于白癜風(fēng)患者的臨床治療。楊慧蘭等[19]用桃仁、紅花、赤芍、丹參、丹皮等成分合成的復(fù)方中藥“白癜沖劑”，能提高酪氨酸酶mRNA的表達(dá)，增加黑素合成，臨床治療白癜風(fēng)療效明顯。最新報(bào)道，有學(xué)者[20]從中醫(yī)治療白癜風(fēng)的方劑中篩選其中的45味進(jìn)行相關(guān)的酪氨酸酶活性影響實(shí)驗(yàn)，顯示有21種對(duì)酪氨酸酶有一定的激活作用，其中以女貞子的作用最明顯。

酪氨酸酶抑制劑和激活劑作為皮膚美白產(chǎn)品及黑素缺失性疾病的臨床用藥，將是相關(guān)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象，天然來(lái)源的中藥具有廣闊的應(yīng)用前景。后續(xù)的研究有必要進(jìn)一步對(duì)其中有效成分進(jìn)行分離純化，驗(yàn)證其中有效化學(xué)成分，著重將增效減毒作為重點(diǎn)研發(fā)方向，明確其應(yīng)用價(jià)值。

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編輯/李陽(yáng)利

2014-10-09

2014-11-28