花生四烯酸細(xì)胞色素P450代謝途徑在高血壓中作用的研究進(jìn)展

嚴(yán) 婧，賈偉平

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海市糖尿病研究所，上海 200233）

高血壓是最常見的慢性病，以體循環(huán)收縮壓和（或）舒張壓持續(xù)升高為主要臨床表現(xiàn)。其是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素，影響重要臟器如心、腦、腎的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭。花生四烯酸（arachidonic acids，AA）屬于二十碳多不飽和脂肪酸，以磷脂化的形式存在于細(xì)胞膜內(nèi)表面。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，由磷脂酶A2水解釋放至細(xì)胞漿中，分別經(jīng)過環(huán)氧化酶（cyclooxygenases，COXs）途徑、脂氧化酶（lipoxygenases，LOXs）途徑和細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）等三大代謝途徑產(chǎn)生近百種具有不同生物活性的小分子代謝產(chǎn)物。之前的研究多聚焦于前兩大途徑在代謝性疾病中的作用，而越來越多的研究證實CYP基因及其介導(dǎo)的AA代謝物在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[1]。本文就其研究的新近進(jìn)展做一綜述。

CYP450基因編碼的CYP450同工酶家族屬于血紅蛋白超級家族，調(diào)節(jié)內(nèi)、外源性物質(zhì)的氧化代謝，其催化AA代謝的過程主要分為兩條通路：一是經(jīng)CYP表氧化酶CYP2家族的CYP2J2，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19代謝生成表氧-二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EET），包括5，6?、8，9?、11，12?、14，15?EET 4種異構(gòu)體；二是經(jīng)CYP ω-羥化酶CYP4A，CYP4F，CYP1A家族的CYP4A11，CYP4F2，CYP4F3b，CYP4F11，CYP4F12等生成20羥－二十烷四烯酸（20- hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）和19羥?二十烷四烯酸（19-hydroxyeicosatetraenoic acid，19-HETE）。

1 花生四烯酸CYP代謝途徑在高血壓中的作用

1.1 動物實驗

早期Holla等[2]研究顯示，全身性敲除cyp4a14基因的小鼠，其腎臟中cyp4a12表達(dá)上調(diào)，致其下游產(chǎn)物20-HETE的含量增加從而升高血壓。同樣，過表達(dá)CYP4f2的轉(zhuǎn)基因小鼠可通過升高20-HETE/EET的比例從而升高血壓，而CYP ω-羥化酶抑制劑HET0016則可阻斷該升壓效應(yīng)[3]。目前越來越多的動物實驗研究證明，20-HETE，EET在自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously genetic hypertension rat，SHR）、去氧皮質(zhì)酮醋酸鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠（DOCA-salt）等多種高血壓大鼠體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)節(jié)血管收縮、腎臟鹽代謝的重要作用。Zhao等[4]通過血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠發(fā)生鹽敏感性高血壓后，即便隨后撤除了血管緊張素Ⅱ的干預(yù)，小鼠仍表現(xiàn)持續(xù)高血壓，這可能與腎臟微血管中CYP2j、CYP2c基因表達(dá)下調(diào)從而影響EET含量有關(guān)。

1.2 人群研究

CYP代謝途徑與高血壓的相關(guān)性已在多項人群研究中報道。Ward等[5]發(fā)現(xiàn)女性中高血壓者尿中20-HETE的排泄率較正常血壓者顯著增加，并且該排泄率與收縮壓、舒張壓呈正相關(guān)。在超重人群中血漿20-HETE水平和24h收縮壓呈正相關(guān)[6]。在關(guān)于20-HETE調(diào)節(jié)排鈉作用的研究中，鹽抵抗性高血壓者的尿鈉排泄率與20-HETE水平呈正相關(guān)，而鹽敏感性高血壓者的尿鈉排泄率則與20-HETE并不相關(guān)[7]。同時，已有遺傳學(xué)研究對CYP4A、CYP4F、CYP2J等基因多態(tài)性與高血壓的相關(guān)性進(jìn)行了初步探討。2005年，Gainer報道了歐洲人群中CYP4A11上功能性的變異8590T＞C（rs1126742）與血壓升高有關(guān)，且隨著風(fēng)險等位基因C數(shù)目的增加，機(jī)體鹽敏感性也隨之增加[8]，之后不同種族的研究亦得到了相類似的結(jié)果[9]。而另一項研究顯示CYP4F2上V433M的GA/AA基因型者20-HETE排泄率及收縮壓都顯著升高，CYP4A11上F434S的CC/TC基因型者則20-HETE排泄率降低，且該多態(tài)性與血壓沒有直接關(guān)聯(lián)[10]。此外，CYP4A11上的rs9332982、rs4660980，CYP4F2上的378T＞C（rs3093098）、421G＞C（rs3093100）均被證實與中國漢族人高血壓發(fā)病及血壓水平相關(guān)[11]。同樣，CYP2J2啟動子區(qū)域的50G＞T（rs890293）也與高血壓相關(guān)，在非糖尿病和肥胖的人群中，T等位基因攜帶者患高血壓的風(fēng)險更高，OR＝8.4（P＝0.0002）[12]，這可能是由于該多態(tài)性使其上游啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合障礙由此引起CYP2J2酶活性的降低。當(dāng)然，由于人種、性別、環(huán)境因素、研究樣本等因素，關(guān)于CYP家族基因多態(tài)性與高血壓關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果并不一致，因此還需要大樣本驗證及相關(guān)功能學(xué)研究證實。

2 CYP代謝途徑在高血壓中作用的分子機(jī)制

2.1 20-HETE

AA的CYP代謝途徑對血壓的調(diào)節(jié)作用主要通過下游小分子20-HETE和EET發(fā)揮效應(yīng)。20-HETE主要在血管平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、外周血及骨髓中的髓樣細(xì)胞中產(chǎn)生，其參與調(diào)節(jié)血壓的機(jī)制十分復(fù)雜。

2.1.1 微循環(huán) 在微循環(huán)（腎、大腦、腸系膜、骨骼肌小動脈）中，20-HETE作為第二信使，主要通過收縮血管、使內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化以及作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等4個方面來發(fā)揮升高血壓的效應(yīng)。

第一，20-HETE通過活化PKC-MAPK通路從而抑制平滑肌細(xì)胞膜上Ca2+激活的K+通道，使膜去極化并引起[Ca2+]i升高，導(dǎo)致平滑肌張力增加引起血壓升高，該作用還可能與L型Ca2+通道激活有關(guān)。20-HETE可以活化Rho激酶，使肌球蛋白輕鏈20（myosin light chain 20，MLC20）磷酸化，從而提高平滑肌細(xì)胞對Ca2+促收縮作用的敏感性[13]。瞬時受體電位C通道6（transient receptor potential C channel 6，TRPC6）在細(xì)胞膜上構(gòu)成Ca2+可通透的非選擇性陽離子通道，近期Inoue等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE對TRPC6的協(xié)同活化作用可以增加Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)血管平滑肌收縮升高血壓。此外，有研究指出，20-HETE通過激活血管周圍神經(jīng)纖維中的瞬時受體電位香草酸亞型1通道（transient receptor potential family vanilloid subtype 1，TRPV1），引起了縮血管神經(jīng)肽P物質(zhì)的釋放，從而部分介導(dǎo)了其收縮血管、升高血壓的效應(yīng)。在野生型雄小鼠中，隨著輸注20-HETE濃度增加，其平均動脈壓也隨之增加。20-HETE這種劑量依賴性地升高血壓的作用卻在TPRV1敲除的雄小鼠中被抑制；同時，向野生型雄小鼠中注入神經(jīng)肽P物質(zhì)受體拮抗劑RP67580后表現(xiàn)出相似的阻斷效應(yīng)[15]。當(dāng)然，20-HETE/TRPV1途徑并未在雌小鼠中證實。

第二，20-HETE作用于內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）-NO、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）系統(tǒng)，通過減少舒血管因子NO、增加超氧陰離子（·O2-）導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[16]。內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO由L-精氨酸、氧經(jīng)eNOS催化形成，eNOS正常發(fā)揮作用依賴于分子伴侶HSP90的存在。而20-HETE作用于eNOS-HSP90復(fù)合體導(dǎo)致其解偶聯(lián)，從而引起NO含量及生物活性降低；同時，·O2-是ROS的成員，大多由NADPH在NADPH氧化酶的作用下產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE會引起小鼠體內(nèi)NADPH氧化酶的組分gp91 phox增加，小鼠腎葉間動脈內(nèi)皮細(xì)胞的·O2-增加[17]。這些均使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而引起血壓升高。

第三，20-HETE可通過活化MAPK-ERK1/2通路來刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化。該通路通過下游級聯(lián)反應(yīng)IKK—IκB磷酸化—核因子-κB（nuclear factor-κB）轉(zhuǎn)位，進(jìn)而引起促炎癥細(xì)胞因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞的持續(xù)活化造成的慢性炎癥狀態(tài)進(jìn)而引發(fā)血壓升高。研究者發(fā)現(xiàn)使用IKK抑制劑白菊可以明顯減輕20-HETE介導(dǎo)的血壓升高，實驗組高血壓小鼠平均血壓從（133.7±3.1）mmHg（1mmHg＝0.133kPa）降到（109.8±3.0）mmHg[16]。同時，向SHR的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞輸注外源性的20-HETE 24h后，細(xì)胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增加，血管中炎癥因子腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6的表達(dá)水平也增加，而20-HETE抑制劑HET0016可使三者表達(dá)均減少[18]。最近，Cheng等[1]發(fā)現(xiàn)20-HETE引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞活化的作用共用TK-MAPK-IKK這條上游通路。使用TK抑制劑染料木黃酮（genistein）或者M(jìn)APK磷酸化抑制劑U0126，均導(dǎo)致20-HETE抑制NO的作用減弱了30%。

第四，20-HETE還可通過IKK通路作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。20-HETE可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE），使血管緊張素Ⅱ水平（AngⅡ）升高，進(jìn)而通過血管緊張素1型受體（angiotensin type 1 receptor，AT1R）發(fā)揮收縮小動脈平滑肌、增加外周血管阻力、刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌醛固酮使水鈉潴留的升壓效應(yīng)。向正常血壓的Sprague-Dawley小鼠的尾靜脈中注射過表達(dá)CYP4A2的慢病毒，其血壓于注射后第3、5、10天分別升高到（139±1）、（145±3）、（150±2）mmHg，血管內(nèi)20-HETE含量明顯增加，同時ACE、AT1R蛋白水平均升高為對照組的2倍，而三者經(jīng)HET0016處理后，含量均較前明顯減少[19]。

2.1.2 腎小管 20-HETE除了升壓效應(yīng)外，在腎小管內(nèi)則起降壓作用。20-HETE通過抑制近端小管對Na+和水的重吸收，在髓袢升支粗段（ascending thick limb of Henle’s loop，TALH）抑制Na+-K+-ATP酶活性、Na+/H+交換體（NHE3）、Na+-K+-2Cl?共轉(zhuǎn)運(yùn)體同種型2（Na+-K+-2Cl?cotransporter isoform 2，NKCC2）從而發(fā)揮降壓的作用[20]。其中，20-HETE通過激活PKC的α亞單位磷酸化從而使Na+-K+-ATP酶活性受抑制導(dǎo)致Na+排出增加。而NKCC2位于TALH頂膜區(qū)域，可將2個Cl?、1個Na+和1個K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，并且專司進(jìn)入TALH的80%的Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此其功能受抑制導(dǎo)致了尿Na+排出增加。研究表明，正常鹽濃度喂養(yǎng)的過表達(dá)CYP4F2的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKCC2的mRNA水平顯著降低，同時腎臟的免疫熒光圖像也顯示NKCC2蛋白含量平行減少，而這種現(xiàn)象可被HET0016逆轉(zhuǎn)。具體機(jī)制可能是20-HETE促進(jìn)NKCC2蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解[21]。

2.2 EET

EET經(jīng)CYP表氧化酶代謝途徑產(chǎn)生，可被可溶性表氧化水解酶水解為弱生物學(xué)活性的二羥基-20碳三烯酸。現(xiàn)有研究表明，EET是有力的擴(kuò)血管物，其作用同內(nèi)皮超級化衍生因子，通過活化冠狀動脈、腎、腦血管的平滑肌細(xì)胞的Ca2+激活的K+通道，使Ca2+內(nèi)流增加、K+外流增加，從而使細(xì)胞膜超極化而產(chǎn)生血管舒張作用，介導(dǎo)血壓降低[22]。同時，CYP表氧化酶在腎中高度表達(dá)，大量研究表明EET可抑制位于腎遠(yuǎn)曲小管和皮質(zhì)集合管的上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）的活性，使ENaC對Na+重吸收作用受到抑制繼而降低血壓。Pavlvo等[23]向體外培養(yǎng)的皮質(zhì)集合管細(xì)胞（mpkCCD）中輸注150nmol/L 11，12-EET，用配對細(xì)胞貼附膜片鉗夾實驗方法檢測ENaC活性，結(jié)果ENaC活性（NP0）在5min內(nèi)迅速從（2.14±0.85）降到（0.56±0.33），而事先應(yīng)用CYP表氧化酶抑制劑MS-PPOH處理后，ENaC活性未改變。由于用EET長時間處理mpkCCD或在表達(dá)ENaC的倉鼠卵巢細(xì)胞中過表達(dá)CYP2C8基因能顯著減少細(xì)胞膜上ENaC蛋白的表達(dá)，考慮到EET抑制ENaC的作用機(jī)制涉及到減少細(xì)胞膜上ENaC蛋白的表達(dá)。此外，EET還可激活EGFR介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)MEK/ERK1/2介導(dǎo)的ENaC的β、γ亞單位蘇氨酸磷酸化從而抑制通道活性[24]。除了作用于ENaC，EET還抑制皮質(zhì)集合管基底膜的主要K通道——18ps內(nèi)向整流K通道，使細(xì)胞膜電位去極化，從而減弱頂膜上驅(qū)使Na+內(nèi)流的動力。與之相反，EET卻能激活皮質(zhì)集合管頂膜中Ca2+活化的大電導(dǎo)K+通道。該通道的α亞單位存在1個插入了59個氨基酸的剪接異構(gòu)體——選擇性剪接壓力調(diào)節(jié)外顯子STREX，PKA可通過插入STREX來抑制K+通道，而STREX的去磷酸化可以使該通道被激活。11，12-EET可激活蛋白磷酸酶2A介導(dǎo)STREX去磷酸化，開放K+通道使入球小動脈平滑肌細(xì)胞超極化而產(chǎn)生舒張血管[25]。

3 展 望

鑒于參與AA代謝的CYP途徑通過各種機(jī)制在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要效應(yīng)，因而編碼CYP家族參與AA代謝的關(guān)鍵基因CYP及代謝通路中的下游小分子20-HETE、EET都有望成為治療高血壓的新靶點。例如，17-ODYA、DDMS、DDBB、HET0016可以抑制20-HETE合成，20-HETE拮抗劑6-，15-，20-HEDE、6-，15-，20-HEDGE具有抑制20-HETE的收縮血管作用，20-HETE類似物5-，14-，20-HEDE、5-，14-，20-HEDGE，PPAR-α激動劑（貝特類）以及通過基因治療可以增加20-HETE在腎小管中的水平，從而發(fā)揮降壓效應(yīng)。此外，對CYP基因多態(tài)性與高血壓的遺傳學(xué)研究還僅僅局限于常見變異，對其在人群中的功能學(xué)研究也僅有少數(shù)報道。如何發(fā)現(xiàn)與高血壓相關(guān)的CYP罕見變異并且解析這些功能性變異參與疾病發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制，繼而為治療高血壓提供新的思路仍是我們亟需解決的難題。

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