急性百草枯中毒大鼠肺組織Toll樣受體4和核因子—κB表達(dá)的變化

陸如鳳 黃小民 吳海波 張卓一 丁黎敏 吳麗娟 徐儷穎

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.010

基金項(xiàng)目：浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2012ZB039，2013ZA056）;浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2013KYA141）

作者單位：310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科（陸如鳳，黃小民，張卓一，丁黎敏，吳麗娟，徐儷穎）;浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程所（吳海波）

通信作者：黃小民，Email： Mxh251770@aliyun.com

【摘要】目的觀察急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺組織中Toll樣受體4（TLR4）和核因子-κB（NF-κB） mRNA表達(dá)的變化，探討TLR4-NF-κB通路在急性PQ中毒肺損傷中的作用。方法30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組：生理鹽水（NS）對(duì)照組（6只，NS腹腔注射），PQ染毒組（24只，腹腔注射PQ溶液，20 mg/kg）。PQ染毒組分別在染毒后6、24、48 h及72 h麻醉處死， NS對(duì)照組于處理后6 h處死，進(jìn)行肺組織HE染色，病理學(xué)觀察，用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)TLR4和NF-κB的mRNA表達(dá)情況，用ELISA方法測(cè)定肺組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清中IL-6含量。結(jié)果PQ染毒組大鼠肺組織病理表現(xiàn)為早期充血水腫明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與NS對(duì)照組相比PQ染毒組肺組織中TLR4和NF-κB mRNA的表達(dá)量、TNF-α、IL-6含量在各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論大鼠急性PQ中毒后肺組織中TLR4和NF-κBmRNA表達(dá)量、TNF-α、IL-6含量明顯上調(diào)，TLR4-NF-κB通路參與了PQ中毒大鼠肺損傷的早期病理生理過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】百草枯;急性肺損傷;大鼠;肺組織;Toll樣受體4;核因子-κB;腫瘤壞死因子-α;白細(xì)胞介素-6

Expressions of toll-like receptor 4 mRNA and nuclear factor-κB mRNA in lung tissue of rats with acute paraquat poisoning

Lu Rufeng， Huang Xiaomin， Wu Haibo， Zhang Zhuoyi， Ding Limin，Wu Lijuan，Xu Liying. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310006，China

Corresponding author： Huang Xiaomin， Email： Mxh251770@ aliyun.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expressions of toll-like receptor 4 mRNA and nuclear factor-κB （TLR4-NF-κB） mRNA in lung tissue of rats with acute paraquat poisoning. MethodsThirty male SD rats were randomly divided into two groups， namely normal saline group （NS group， n=6） and the PQ groups （n=24）. The rats of PQ group were administered with 20 mg/kg PQ by intraperitoneal injection to establish the models of PQ induced lung injury. The saline was administered once instead in normal saline group. The rats of PQ group were sacrificed separately at 6 h，12 h，24 h，48 h and 72 hours after modeling， while at 6 hours the rats of normal saline group was sacrificed.The expressions of TLR4 mRNA， NF-κB mRNA，and the levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in lung （serum） of rats were detected.Meanwhile， pathological changes of the lung tissue were examined under optical microscope.Results There were no histopathological changes such as alveolar edema，hemorrhage and inflammatory cell infiltration found in NS group other than in PQ group. At the 72 h， the expressions of TLR4 mRNA （9.61±0.21），NF-κB mRNA （5.62±0.24）， and the levels of TNF-α（153.08±5.02） pg/ml， and interleukin-6 （230.08±10.64） pg/mL in lung tissue of rats were significantly higher in PQ group than those in control group （P<0.01）. ConclusionsIn rats after PQ poisoning， the expressions of TLR4 mRNA， NF-κB mRNA， and the levels of TNF-αand IL-6 were higher than those in normal rats， and the TLR4-NF-κB pathway could play an important role in lung injury of rats with PQ poisoning.

【Key words】Paraquat;Acute lung injury;Rat;Lung tissue;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-κB;Tumor necrosis factor-α;Interleukin-6

百草枯（paraquat，PQ）是一種非選擇性、接觸性除草劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。目前PQ中毒無(wú)特效解毒藥，常規(guī)對(duì)癥處理效果極差，口服病死率高達(dá)60%以上^[1-3]。PQ中毒特征性改變是急性肺損傷（acute lung injury，ALI），主要是由于肺泡I型和Ⅱ型上皮細(xì)胞早期的破壞和肺泡炎、肺水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的，并最終引起肺纖維化^[2，4]。PQ引起的ALI和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是PQ中毒致死的主要原因，而相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。近年研究結(jié)果顯示TLR4、NF-κB參與了脂多糖和病毒感染所致小鼠肺損傷的過(guò)程，并能釋放大量炎癥因子，引起臟器損傷^[5-6]。本研究通過(guò)腹腔注射PQ的方法，建立大鼠急性PQ中毒肺損傷模型，觀察大鼠急性PQ中毒后肺組織中TLR4和NF-κBmRNA及炎癥因子表達(dá)的變化，對(duì)PQ中毒ALI作用機(jī)制做了初步探討。

1材料與方法

1.1材料及試劑

健康雄性SD大鼠體質(zhì)量200～220 g，清潔級(jí)，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并在清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)（許可證：SCXK（浙）2008-0033號(hào)）。PQ為青島瀚生生物科技股份有限公司產(chǎn)品（20110210057），TNF-α ELISA試劑盒為NeoBioscience產(chǎn)品（R120822-12a），IL-6 ELISA試劑盒為NeoBioscience產(chǎn)品（R120822-06a）。TRIzol試劑為美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為大連寶生物產(chǎn)品，SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑為北京康為世紀(jì)產(chǎn)品。全自動(dòng)石蠟切片機(jī)為德國(guó)Leica產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品，酶標(biāo)檢測(cè)儀為美國(guó)BioRad產(chǎn)品，熒光定量PCR儀美國(guó)Corbett Research產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物分組及模型建立

將30只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為生理鹽水（NS）對(duì)照組和PQ染毒組，NS對(duì)照組6只，給予1 mL NS腹腔注射。PQ染毒組24只，予PQ溶液20 mg/kg，用NS稀釋至1 mL，一次性腹腔注射染毒，建立大鼠PQ中毒模型。

1.3標(biāo)本采集與檢測(cè)

NS對(duì)照組于處理后6 h，PQ染毒組于染毒后6、24、48、72 h各取6只，用25%烏拉坦溶液麻醉，股動(dòng)脈取血處死大鼠。處死后開(kāi)胸取肺組織，取左肺相同部分固定于10%甲醛液內(nèi)，經(jīng)石蠟包埋、切片和HE染色，觀察組織學(xué)變化。常規(guī)分離獲得血清，對(duì)IL-6含量進(jìn)行測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。對(duì)肺組織中TNF-α、TLR4-NF-κB mRNA表達(dá)水平測(cè)定，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件17.0進(jìn)行分析。各組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA，兩兩比較用最小的顯著差異法分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠急性PQ中毒臨床表現(xiàn)

PQ染毒組大鼠在染毒后2 h開(kāi)始出現(xiàn)精神不佳，出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、拱背、步態(tài)蹣跚，12 h后則出現(xiàn)口唇發(fā)紺、后肢無(wú)力、仰臥，并伴有呼吸加深加快等現(xiàn)象，24h時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呼吸急促甚至呼吸窘迫等各種癥狀，部分大鼠出現(xiàn)血尿、眼球出血等現(xiàn)象。

2.2肺組織TLR4和NF-κB mRNA及炎癥因子表達(dá)

大鼠染毒后肺組織中的TLR4表達(dá)量發(fā)生了改變，染毒第6 h后，TLR4基因mRNA表達(dá)量提高到6.8倍以上，并且隨時(shí)間改變而增加，第48小時(shí)達(dá)到最高，為12.82倍，之后開(kāi)始下降。大鼠染毒后肺組織中NF-κB表達(dá)量發(fā)生了改變，也隨著時(shí)間的增加而增加，48 h后為最高，提高到6.99倍，之后開(kāi)始下降。因此，總體上，大鼠染毒后肺組織TLR4和NF-κB表達(dá)量的改變趨勢(shì)基本一致，都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，在第48 h達(dá)到最高值，之后逐漸下降。與NS對(duì)照組相比較，PQ染毒組的肺組織勻漿中TNF-α含量有顯著增加（P<0.01），并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷提高;PQ染毒組大鼠血清中的IL-6含量有顯著增加（P<0.01），也隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷提高，見(jiàn)表2。

2.3急性PQ中毒大鼠肺組織病理改變

NS對(duì)照組解剖見(jiàn)肺組織呈均勻粉紅色，胸腔無(wú)滲出液，在普通光學(xué)顯微鏡下，可見(jiàn)NS對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及支氣管腔內(nèi)未見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞及滲出物，可見(jiàn)少量紅細(xì)胞。PQ染毒組大鼠肺臟組織外觀具有明顯的水腫，充血，在水中能夠沉入水底;在普通光學(xué)顯微鏡下，切片觀察可見(jiàn)肺組織發(fā)生水腫，部分有透明膜形成，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷萎縮和變窄，甚至結(jié)構(gòu)消失，肺泡間隔明顯增厚，隨時(shí)間的延長(zhǎng)肺組織損傷程度加重，見(jiàn)圖1。

3討論

PQ中毒后可造成全身多器官損傷，其中以肺損傷最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為早期肺泡上皮細(xì)胞受損，肺泡內(nèi)出血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而發(fā)生I型呼吸衰竭，晚期則出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)參與了PQ中毒肺損傷，PQ中毒后大量前炎因子啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，其中TNF-α和IL-6與ALI/ARDS關(guān)系最為密切^[7]。TNF-α在炎癥反應(yīng)中具有始動(dòng)和關(guān)鍵的促炎免疫作用，臨床研究表明，急性PQ中毒后多器官功能障礙綜合征患者血清TNF-α含量較正常組明顯升高^[8]。胡軍利等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PQ中毒大鼠血清中TNF-α含量在1～3 d具有很高的表達(dá)水平，與正常組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義^[9]。在本研究中，PQ染毒組肺組織勻漿中TNF-α含量有顯著增加，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷提高，在所觀察的72 h內(nèi)，第72 h為最高值并且。IL-6是急性肺損傷和肺纖維化中主要的炎癥細(xì)胞因子之一，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、急性期反應(yīng)和血細(xì)胞生成，并在宿主防御機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。在臨床的相關(guān)觀察中也發(fā)現(xiàn)急性PQ中毒后ARDS患者血清IL-6含量與正常人相比較也具有明顯升高^[10]，在實(shí)驗(yàn)染毒大鼠血清中的IL-6含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，并在第3d達(dá)到峰值^[11]。本研究結(jié)果表明，PQ染毒組大鼠血清中IL-6含量有顯著增加，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷提高，在所觀察的72 h內(nèi)，第72 h為最高值。

全身炎癥反應(yīng)綜合征是PQ中毒的常見(jiàn)并發(fā)癥，是通向多器官功能障礙綜合征的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，而核因子-κB（NF-κB）是核內(nèi)炎性遞質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)^[12-13]?；罨蟮腘F-κB可誘發(fā)TNF-α、IL-6、IL-8及繼發(fā)性炎癥因子形成“細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)”啟動(dòng)肺部炎癥^[14]。PQ中毒后肺組織中TNF-α水平有所增高，TNF-α可以觸發(fā)白細(xì)胞三烯和前列腺素E2的合成，然后刺激中性粒細(xì)胞對(duì)肺臟的浸潤(rùn)，從而引起肺損傷^[15]。相關(guān)研究表明，TLR4—NF-κB通路的激活能夠增強(qiáng)TNF-α、IL-6等眾多細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)感染細(xì)胞分泌炎癥因子和I型干擾素，啟動(dòng)免疫應(yīng)答^[5-6]。先前研究表明，大鼠在PQ中毒誘導(dǎo)的肺損傷過(guò)程中，1～14 d中的肺組織NF-κB活性均明顯升高，活性值在3 d為最高點(diǎn)，為正常的6.59和8.35倍^[9，12]。在本研究中，染毒組中由PQ中毒所致大鼠急性肺損傷的肺組織中TLR4表達(dá)量改變也較為明顯，與NS對(duì)照組具有顯著提高，提示TLR4對(duì)百草枯這種化合物具有一定的識(shí)別作用。而同時(shí)，在急性PQ中毒大鼠肺組織內(nèi)，NF-κB表達(dá)量具有明顯增加，在48 h達(dá)到最高值，之后也保持了較高水平，這與先前的研究結(jié)果基本一致。

本研究結(jié)果顯示，大鼠急性PQ染毒后出現(xiàn)明顯的呼吸困難等急性肺損傷表現(xiàn)，肺組織病理顯示肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴充血水腫。大鼠肺組織病理改變趨勢(shì)與肺組織中TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α和IL-6的變化趨勢(shì)基本一致。綜上所述，大鼠急性PQ中毒后肺組織中TLR4、NF-κB mRNA、TNF-α和IL-6的表達(dá)明顯上調(diào)，表明TLR4—NF-κB通路參與了PQ中毒大鼠ALI的早期病理生理過(guò)程。通過(guò)阻斷TLR4—NF-κB的激活，將有助于抑制PQ中毒患者病情的發(fā)生與發(fā)展。

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（收稿日期：2014-07-19）

（本文編輯：何小軍）

p1344-1347