培養(yǎng)基成分對仁用杏花粉離體萌發(fā)的影響

金亞征，忻龍祚，王建民，俞鳳芳

(河北北方學院 園藝系，河北 張家口 075000)

仁用杏是以杏仁為主要產品的杏屬果樹的總稱。杏仁包括甜杏仁和苦杏仁2種，蛋白質、粗脂肪、礦物質、不飽和脂肪酸等含量高，此外，杏仁中還含有胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸等藥用成分，具有較高的食用價值和藥用價值[1]。主要分布在河北、遼寧、甘肅、內蒙、山西、山西、新疆等地，是我國的優(yōu)勢經濟樹種。我國是唯一生產和出口杏仁的國家，全球對仁用杏的需求量越來越多，市場前景十分廣闊[2]。但目前仁用杏生產存在產量低、產量不穩(wěn)、出仁率低、品質差等問題，供需矛盾突出[3]。造成仁用杏坐果率低的主要原因是凍花凍果[4-6]、花器官敗育[6-9]、開花特性[10]、管理粗放[11]等。文中以仁用杏‘優(yōu)一’為材料，探尋仁用杏花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基的成分及濃度，以期為提高仁用杏坐果率、降低花粉敗育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為仁用杏‘優(yōu)一’品種。于大蕾期選擇10株長勢均勻的樹體，在樹體不同部位隨機采集含苞待放的花朵數朵，組成混合樣，帶回室內。用鑷子撥開花瓣，取下花藥，放到硫酸紙上，在室內自然陰干，待花藥炸裂時收集花粉，將花粉過篩去除雜質，收集到指形離心管中，裝入黑色塑料袋中保存到溫度為-25℃的冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗方案

(1)單因素試驗 單因素試驗均采用固體瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂0.1g·L-1)，分別為蔗糖、硼酸(各處理添加1g·L-1蔗糖)、二水合氯化鈣(各處理添加1g·L-1蔗糖)、赤霉素素(純度≥98％，各處理添加1g·L-1蔗糖)處理，最后用1 mol/L的NaOH、HCl將所有處理的培養(yǎng)基pH值調至5.2。單因素試驗各處理的濃度梯度如表1所示。

表1 單因素試驗各處理的濃度梯度Table 1 Concentration gradient of each treatment under single factor experiment

(2)正交試驗 在單因素試驗的基礎上采用L25(56)正交試驗設計。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將熬制好的花粉培養(yǎng)基用玻璃棒均勻滴到凹形載玻片上，用消毒后的頭發(fā)絲蘸取花粉均勻涂抹到培養(yǎng)基上，播好的玻片放到有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，氣候箱的溫度設為25℃，濕度30％，光照調為0，在暗環(huán)境里開始培養(yǎng)，單因素試驗6h后統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，正交試驗分別培養(yǎng)2、4、6h，其間進行觀察，每個處理重復3次。

1.2.3 數據統(tǒng)計與分析

在10×10顯微鏡下觀察統(tǒng)計?；ǚ酃荛L度等于或超過花粉粒直徑視為已萌發(fā)，每處理統(tǒng)計5個視野，每個視野花粉不少于50粒，至少3個重復?；ǚ叟囵B(yǎng)6h后，每個視野隨機選擇10條已萌發(fā)的花粉管用目鏡測微尺測量長度，3次重復，同時用奧林巴斯CX21相機照相。

花粉萌發(fā)勢＝(規(guī)定時間內花粉萌發(fā)數/花粉萌發(fā)總數)×100％。

方差分析采用SPSS軟件，多重比較用duncan法(新復極差法)。

2 結果與分析

2.1 單因素處理對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

2.1.1 蔗糖對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

‘優(yōu)一’在不同體積分數蔗糖培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)率隨著蔗糖體積分數的增加呈現先增后減的趨勢(見圖1)。適宜的蔗糖體積分數可以明顯提高‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率，15％的蔗糖是‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的較適宜體積分數，花粉萌發(fā)率達27.1％，較其它處理在0.05水平上差異顯著。當蔗糖體積分數超過15％，花粉萌發(fā)率開始下降，高體積分數蔗糖則抑制了花粉的萌發(fā)，但仍高于低體積分數5％、10％的萌發(fā)率，在0.05水平上差異顯著。

圖1 不同蔗糖濃度下‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率Fig.1 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different volume fractions of sucrose

2.1.2 硼酸對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

在10％蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的硼酸，隨著硼酸質量濃度的增加，‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率有顯著增加，當硼酸質量濃度達0.003g·L-1時，花粉萌發(fā)率達到最高值38.8％，較其它質量濃度處理在0.05水平上差異顯著。當硼酸質量濃度超過0.003g·L-1時，花粉的萌發(fā)率開始下降，高質量濃度的硼酸抑制了花粉的萌發(fā)(見圖2)。

圖2 不同硼酸質量濃度下‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率Fig.2 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different mass concentrations of boric acid

2.1.3 二水合氯化鈣對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

在10％蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的Ca2+，‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率如圖3所示。由圖3可知，低質量濃度的Ca2+可增加‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率，較高質量濃度的Ca2+則明顯抑制了花粉的萌發(fā)。當二水合氯化鈣質量濃度從0.000 1g·L-1增加到0.000 2g·L-1，‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率從14.5％增加到19.3％，隨著二水合氯化鈣質量濃度的增加花粉的萌發(fā)率開始呈現下降趨勢，花粉萌發(fā)率明顯低于0.000 2、0.000 1g·L-12個處理的萌發(fā)率，差異均達到顯著水平。

圖3 不同鈣離子質量濃度下‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率Fig.3 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different Ca2+ mass concentrations

2.1.4 赤霉素對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

在10％蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的GA3，‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率如圖4所示。隨著赤霉素質量濃度的增加，花粉萌發(fā)率的增加趨勢明顯，當GA3質量濃度為0.000 8g·L-1時花粉萌發(fā)率最高34.9％，與其它處理的萌發(fā)率在0.05水平上均有顯著差異。當GA3質量濃度超過0.000 8g·L-1時，花粉萌發(fā)率開始下降，高濃度的赤霉素濃度抑制了‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)。

圖4 不同GA3質量濃度下‘優(yōu)一’花粉的萌發(fā)率Fig.4 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different mass concentrations of GA3

2.2 單因素處理對‘優(yōu)一’花粉管生長的影響

2.2.1 花粉管長度

蔗糖、10％蔗糖+硼酸、10％蔗糖+二水合氯化鈣、10％蔗糖+赤霉素不同質量濃度對‘優(yōu)一’花粉管生長有不同影響，結果如圖5所示。蔗糖、10％蔗糖+硼酸、10％蔗糖+氯化鈣3種單因素處理對‘優(yōu)一’花粉管生長的影響表現一致，即均隨著蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣質量濃度的升高表現為“先增后減”的趨勢，即低質量濃度促進生長，高質量濃度抑制生長。當蔗糖質量濃度為15％時，花粉管最長為796.7 μm，當硼酸質量濃度為0.002g·L-1時花粉管最長為905.0 μm，當二水合氯化鈣濃度為0.000 4g·L-1時花粉管最長為971.7 μm。10％蔗糖＋赤霉素處理的表現與前三者不同，表現為隨著赤霉素質量濃度增加，花粉管的生長始終呈現增長趨勢，赤霉素質量濃度從0.000 5g·L-1增加到0.000 9g·L-1時，花粉管長從1 282.3 μm增長至1 669.0 μm(見圖5)。

2.2.2 花粉管生長

‘優(yōu)一’在蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣、赤霉素不同培養(yǎng)基上，10％蔗糖＋赤霉素培養(yǎng)基上花粉管生長量、長度、節(jié)間生長量明顯要高于其它3個處理。花粉管在低質量濃度蔗糖培養(yǎng)基上，花粉壁破裂現象明顯，花粉管頂端破裂，釋放出大量內含物，隨著蔗糖質量濃度的增加，花粉管破裂現象逐漸消失。在10％蔗糖里添加了硼酸、鈣離子和赤霉素的培養(yǎng)基上，無花粉管壁破裂現象。經4種處理培養(yǎng)后比較，在10％蔗糖＋赤霉素培養(yǎng)基上花粉管生長量、長度和節(jié)間生長量明顯高于其它3個處理(見圖6)。

圖5 單因素處理下‘優(yōu)一’花粉管的長度Fig.5 ‘Youyi’pollen tube lengths under the conditions of single factor treatments

2.3 正交試驗各處理對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)的影響

‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)L25(56)正交試驗結果如表2所示，4因素5水平25個水平組合的正交處理對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率的影響不同。培養(yǎng)2h的情況下，以處理14即0.1g·L-1瓊脂＋10％蔗糖＋0.003g·L-1硼酸＋0.000 0g·L-1二水合氯化鈣＋0.000 6g·L-1赤霉素組合的萌發(fā)率最高，達到了38.8％，較其它24個處理組合在0.05水平上差異顯著，其次表現較好的組合是處理19、22、20、13、12。培養(yǎng)4h的情況下，以處理14的萌發(fā)率最高(42.4％)，與其它24個處理組合在0.05水平上差異顯著，其次表現較好的是處理19和24，萌發(fā)率分別達到了39.9％和38.4％。培養(yǎng)6h的情況下，處理14、24、22、20的萌發(fā)率分別為47.4％、47.3％、45.2％、43.7％，4個處理在0.05水平上無顯著差異，高于其它21個處理組合且差異顯著?；ǚ勖劝l(fā)勢結果表明，‘優(yōu)一’花粉在所觀察的3個時間段中，25個處理組合在培養(yǎng)2h時，花粉萌發(fā)率均超過了50％，其中有5個處理達到90％以上，最高的達到96.9％，10個處理達到80％以上，其余的10個處理達到58％～70％；培養(yǎng)4h時，14個處理到了90％以上，最高達99.7％，9個處理達80 ％以上，僅1個處理為74.3％。同時，極差R分析結果表明，培養(yǎng)2、4、6h時，各因素的表現一致，均為蔗糖＞硼酸＞二水合氯化鈣＞赤霉素(見表3)。

圖6 單因素處理下培養(yǎng)6h‘優(yōu)一’花粉管生長情況Fig.6 Growth status of ‘Youyi’pollen tube cultivated for six hours under the conditions of single factor treatments

表2 ‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)L25(56)正交試驗結果?Table 2 Result of L25(56)orthogonal test of ‘Youyi’pollen germination

表3 ‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)L25(56)正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of ‘Youyi’pollen germination in the L25(56)orthogonal test

3 結論與討論

花粉離體萌發(fā)大多采用蔗糖作為基本培養(yǎng)基，蔗糖除了能為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)外,還可以調節(jié)花粉的滲透壓[12]。當培養(yǎng)基中蔗糖體積分數高于花粉內部的滲透壓時，花粉會發(fā)生質壁分離現象，使花粉萌發(fā)受到抑制；而蔗糖體積分數過低時又會造成花粉壁破裂，表現為花粉管頂端破裂，花粉內含物溢出[13]。本研究結果表明，‘優(yōu)一’花粉隨著蔗糖體積分數的增加，花粉萌發(fā)率、花粉管伸長長度均表現“先增后減”的趨勢；且在低體積分數蔗糖培養(yǎng)基中，有部分萌發(fā)的花粉管頂端爆裂，有明顯內含物明顯溢出的現象，隨著蔗糖體積分數增加，花粉壁破裂現象消失。適宜的蔗糖體積分數花粉管生長健壯，花粉的內外滲透壓才能保持平衡，維持正常的生活力，有利于萌發(fā)。

硼的主要作用是參與花粉管頂端細胞壁的形成，增加糖的吸收、運轉和代謝，形成糖硼酸復合體，增加氧的吸收，對迅速伸長的花粉管膜中果膠物質的合成起作用。一般在自然條件下，花粉本身含有一定量的硼，但是含量遠不夠滿足自身萌發(fā)的需要，花粉中自身硼的含量是不足的，往往需要由柱頭和花柱內的硼來補償[14]。文中‘優(yōu)一’花粉在10％蔗糖的離體培養(yǎng)上加入微量元素硼，隨著硼質量濃度的增加，對花粉萌發(fā)及花粉管的伸長具有明顯促進作用，花粉的萌發(fā)率最高達到38.8％，比適宜的單一蔗糖體積分數下的萌發(fā)率27.1％要高，說明在蔗糖培養(yǎng)基中補充一定質量濃度的硼元素是必要的。

Ca2+主要影響花粉萌發(fā)的速度和花粉管生長速度，且能誘導花粉管產生一定的趨向性，從而保持頂端的極性生長。一般認為，由于花粉內存在較多的Ca2+，而缺乏硼素，因此花粉萌發(fā)時，胞外Ca2+對花粉萌發(fā)率的影響不及硼素顯著[15]。文中試驗結果與此觀點一致。鈣離子質量濃度對‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率和花粉管生長長度的影響與硼酸質量濃度的變化趨勢一致，但所需的鈣離子質量濃度遠小于硼離子質量濃度，且10％蔗糖培養(yǎng)基中加入鈣離子的萌發(fā)率比加入硼元素后的萌發(fā)率低，但就花粉管生長速度及花粉管生長長度的促進作用來說，鈣離子優(yōu)于硼元素。

赤霉素能抑制植物體內生長素分解系統(tǒng)的活動，以保證體內生長素含量水平，因此，一定質量濃度的外源赤霉素處理，能促進花粉萌發(fā)和花粉管生長[16]。本試驗在10％蔗糖培養(yǎng)基中添加少量赤霉素，赤霉素在一定質量濃度范圍內對花粉離體萌發(fā)起促進作用，超過一定質量濃度后萌發(fā)率則降低。而在赤霉素質量濃度0.000 5～0.000 9g·L-1設定范圍內，隨著赤霉素質量濃度增加，花粉管伸長始終呈現增長趨勢，增長幅度遠大于其它3個處理。超高質量濃度的赤霉素是否會抑制‘優(yōu)一’花粉管伸長還有待進一步研究。

蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣、赤霉素L25(56)正交試驗結果表明，0.1g·L-1瓊脂＋1g·L-1蔗糖＋0.003g·L-1硼酸＋0.000 0g·L-1二水合氯化鈣＋0.000 6g·L-1赤霉素組合培養(yǎng)2～6h時‘優(yōu)一’花粉萌發(fā)率均表現最高，是花粉萌發(fā)的最佳組合。‘優(yōu)一’花粉在20種組合離體條件下培養(yǎng)2h時，花粉萌發(fā)率均超過50％，培養(yǎng)4h時，有14個處理的花粉萌發(fā)勢達90％以上。此結果表明，‘優(yōu)一’花粉在適宜萌發(fā)條件下，培養(yǎng)2～4h是花粉萌發(fā)的高峰期，且蔗糖、硼酸是影響花粉萌發(fā)的最關鍵因素。

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