刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶活性變化

胡 盈，趙曉妮，孫鳳陽(yáng)，劉弈佳，陶 雷，盧 宏，由香玲

(東北林業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺五加Eleutherococcus senticosusMaxim.為五加科五加屬落葉灌木，別名刺拐棒、刺老芽等。具有抗疲勞、抗衰老，提高免疫力，保護(hù)心血管等作用，是十分珍貴的藥物資源。關(guān)于其藥用成分的研究已有很多報(bào)道[1-2]。近年來(lái)，由于刺五加野生資源匱乏，加之其有性繁殖周期較長(zhǎng)，自然

在通過(guò)質(zhì)壁處理刺五加合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：胼胝質(zhì)(主要成分為β-1,3-葡聚糖)與體細(xì)胞胚發(fā)生呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[19-21]。而體細(xì)胞胚發(fā)生也是植物體適應(yīng)外界脅迫因子產(chǎn)生的一種響應(yīng)。目前還未見(jiàn)普遍存在于高等植物細(xì)胞內(nèi)的2類防御因子——β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶[22]在刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的變化規(guī)律的相關(guān)報(bào)道，這正是本文要探討的問(wèn)題，旨在為刺五加體細(xì)胞胚的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生及取材

在前期試驗(yàn)中獲得了刺五加胚性愈傷組織，掌握了體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育過(guò)程[17]。本試驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。首先將胚性愈傷組織(見(jiàn)圖1A)在增殖培養(yǎng)基(MS＋1.0mg/L 2,4-D)培養(yǎng)，每20d繼代1次，進(jìn)行快速增殖。然后接種到不添加任何激素的MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育。從培養(yǎng)2周開(kāi)始，形成球形體細(xì)胞胚(見(jiàn)圖1B)后，依次經(jīng)歷心型、魚(yú)雷、到第5周發(fā)育為成熟的子葉體細(xì)胞胚(見(jiàn)圖1C)。

圖1 刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程Fig.1 Generating process of somatic embryogenesis in Eleutherococcus senticosus

取增殖培養(yǎng)4周后的胚性愈傷組織，設(shè)為對(duì)照，接種于未添加任何激素的3％蔗糖MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每7d取1次樣，每次取8瓶，并將材料按0.3、0.1g分別稱4份，用液氮冷凍保存于-80℃的冰柜中，分別用于測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性和胼胝質(zhì)含量。另取4份各0.5g材料，立刻進(jìn)行β-1,3-葡聚糖酶的提取，后凍藏保存，用于分析其酶活性。連續(xù)取樣35d。

1.2 幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定

1.2.1 幾丁質(zhì)粗酶液的提取

取冷凍保存的材料(0.3g)放入預(yù)冷的研缽中，加液氮迅速研磨成粉末后，加2.0mL醋酸提取液(0.05 mol/L，pH 5.0)和少量的石英砂，轉(zhuǎn)入2mL離心管，迅速于4℃下12 000r/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

首先配制100μg/mL N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)母液。分別取9支5mL試管編號(hào)1～9號(hào)。將配制的質(zhì)量濃度為 0.0、12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺分別轉(zhuǎn)入有編號(hào)的試管，然后分別加入0.2mL飽和硼砂溶液，沸水浴7min，迅速冷卻后，加2mL冰醋酸、1mL 1％ DMAB，37℃水浴保溫15min后，溶液呈紅色，于585nm波長(zhǎng)處，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度測(cè)定上述反應(yīng)液的吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。取其均值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝0.008 2x-0.015 9(R2＝0.998 8)。

1.2.3 外切幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定

主要參考Reissig等的方法[23]對(duì)外切幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行測(cè)定。依次取0.4mL粗酶提取液、0.4mL醋酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 5.0)和0.4mL膠體幾丁質(zhì)溶液(1％)于試管中。37℃水浴反應(yīng)2h后，4 000r/min離心10min。取0.4mL上清液，加0.2mL飽和硼砂溶液(上清液即刻變黃色)，沸水浴7min，冷卻后再加2mL冰醋酸和1mL 1％對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，立刻于37℃水浴保溫15min后，溶液呈紅色，于585nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)上述建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活性。

1.2.4 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定

取0.4mL上述上清液，加40μL 1％蝸牛酶溶液，繼續(xù)在37℃反應(yīng)30min，用上述Reissig等的方法[23]測(cè)定產(chǎn)生的N-乙酰葡萄糖胺量，即得總幾丁質(zhì)酶活性?？値锥≠|(zhì)酶活性減去外切幾丁質(zhì)酶活性，即為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性。1個(gè)酶活性單位(U)定義為每克鮮植物組織每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1.0μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.3 β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的測(cè)定

1.3.1 β-1,3-葡聚糖含量的測(cè)定

取冷凍保存的材料(0.1g)，用液氮快速研磨成粉末后，用1.0mL 20％乙醇沖洗3次，10 000r/min離心5min，棄上清，除去材料上的熒光。在樣品中加入1.0mL 1.0 mol/L NaOH，80℃水浴15min，以增加胼胝質(zhì)的溶解，再10 000r/min離心15min之后，取上清液0.2mL依次加入0.4mL 0.1％苯胺藍(lán)、0.21mL 1 mol/L HCl、0.59mL 1 mol/L甘氨酸–氫氧化鈉(Gly-NaOH)緩沖液，振蕩器上振蕩混勻，50℃水浴20min，室溫30min直至苯胺藍(lán)變?yōu)闊o(wú)色。空白對(duì)照用0.4mL蒸餾水代替苯胺藍(lán)，最后用熒光分光光度計(jì)測(cè)含量(激發(fā)光400nm和發(fā)射光510nm、激發(fā)狹縫5nm、發(fā)射狹縫5nm、平均時(shí)間0.100 00s)。

以茯苓聚糖(Fluki，Buchs,Switzerlands)作對(duì)照品，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，回歸方程為y＝0.366 4x-0.724 9(R2＝0.995 1)，標(biāo)準(zhǔn)曲線在2～10μg之間為線性。

1.3.2 β-1,3-葡聚糖酶活性的測(cè)定

β-1,3-葡聚糖酶的提取和活性測(cè)定參照史益敏的方法[25]。稱取鮮質(zhì)量0.5g材料，放入預(yù)冷的研缽中，加3.0mL 0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)和0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在冰浴中充分研磨，4℃的環(huán)境下15 000×g離心15min，取上清液在10 000×g下離心10min，所得上清液即為粗酶液，放于冰箱備用。取1.0mg/mL的昆布多糖，溶于0.4mL上述醋酸鈉緩沖液，加入0.1mL酶液，于37℃保溫15min，立即加入0.5mL銅試劑，混勻，并于100℃水浴10min，置冷水中冷卻，再加入0.5mL砷鉬酸試劑，呈現(xiàn)藍(lán)色后加蒸餾水3.5mL，搖勻，660nm波長(zhǎng)的光下比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品液的還原糖含量。以1.0 nmol/(g·s)為1個(gè)酶活性單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中幾丁質(zhì)酶活性的變化

幾丁質(zhì)是絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，植物中不存在；但幾丁質(zhì)酶廣泛存在于自然界，在高等植物中也較為普遍。各種植物、動(dòng)物及微生物細(xì)胞和組織中的幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)水解為寡聚糖，再進(jìn)一步水解為N-酰氨基葡萄糖[25]。按照Yeboah等的建議，根據(jù)水解幾丁質(zhì)切口位置的不同，將幾丁質(zhì)酶分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶；根據(jù)酸堿性，分為酸性幾丁質(zhì)酶和堿性幾丁質(zhì)酶[26]。

在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶活性的變化如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，外切和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中均有顯著變化。從圖2中可以看出，0～14天期間，即球形胚形成時(shí)期，活性逐漸增大，到第14天時(shí)，外切幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到了最大值94.45μg·g-1h-1，是胚性愈傷組織時(shí)期的1.61倍；在體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，外切幾丁質(zhì)酶活性呈下降趨勢(shì)，但均顯著高于對(duì)照；到第35天時(shí)，即子葉胚時(shí)期，外切幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最低，顯著低于體胚發(fā)育的其它時(shí)期(P＜0.05)。

從圖2中可以看出，在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性均高于胚性愈傷組織；整體呈上升趨勢(shì)，到第35天，即在子葉胚期內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最高，為101.15μg·g-1h-1，是對(duì)照的3.76倍(P＜0.05)。

從胚性愈傷組織到成熟子葉期體胚，2種幾丁質(zhì)酶活性的變化規(guī)律完全不同。外切幾丁質(zhì)酶從胚性細(xì)胞到球形期，有顯著的變化，其在體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。類似的在胡蘿卜溫度敏感型細(xì)胞變異系ts11中，如果加入一種來(lái)自野生型胡蘿卜細(xì)胞系的32 kDa酸性幾丁質(zhì)酶后，該變異系ts11能在非適宜溫度下越過(guò)球形胚繼續(xù)發(fā)育，如果不加這種幾丁質(zhì)酶，細(xì)胞系變異系ts11在非適宜溫度下則無(wú)法越過(guò)球形胚時(shí)期[27]。這種32 kDa酸性幾丁質(zhì)酶在鴨茅體細(xì)胞胚發(fā)育的全過(guò)程中均被檢測(cè)到[26]。刺五加體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中，外切幾丁質(zhì)酶的特性、作用還需進(jìn)一步研究。

上述結(jié)果中內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的這種持續(xù)增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，可能與體細(xì)胞胚生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中外植體持續(xù)生長(zhǎng)、需持續(xù)克服外界的各種光照、溫度等培養(yǎng)環(huán)境的脅迫引起。其確切原因需要進(jìn)一步研究。

圖2 體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中幾丁質(zhì)酶活性的變化Fig.2 Changes of chitinase activities during somatic embryogenesis

2.2 體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的變化

從胚性愈傷組織到成熟子葉胚時(shí)期，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性變化如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，第0～14天，即球形體胚形成過(guò)程中，β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性均呈上升趨勢(shì)，在第14天達(dá)到最高，β-1,3-葡聚糖含量為61.43μg·g-1，是胚性愈傷組織中含量(21.89μg·g-1)的2.81倍；β-1,3-葡聚糖酶活性為40.23 U·g-1，是胚性愈傷組織中酶活性(15.92 U·g-1)的2.53倍；而后，在第28天和第35天，即體胚發(fā)育成熟時(shí)期，β-1,3-葡聚含量及其酶活性急速下降；β-1,3-葡聚含量與胚性愈傷組織的差異不顯著(見(jiàn)圖3)，但酶活性顯著低于胚性愈傷組織(見(jiàn)圖3)(P＜0.05)。

圖3 體胚發(fā)生過(guò)程中β-1,3-葡聚糖含量及其酶活性的變化Fig.3 Changes of the β-1,3-glucan content and β-1,3-glucanase activity during somatic embryogenesis

β-1,3-葡聚糖含量變化與其酶活性的變化較一致，只是在體細(xì)胞胚成熟期存在差異。在球形胚時(shí)期，β-1,3-葡聚糖含量與其酶活性均較高。在前期研究刺五加直接體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)含量在整個(gè)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生了規(guī)律性變化，認(rèn)為胼胝質(zhì)即葡聚糖的大量合成是刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生的必要條件[21]。在其它植物的體胚誘導(dǎo)過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)過(guò)類似的β-1,3-葡聚糖含量升高的現(xiàn)象。例如，在誘導(dǎo)菊苣體細(xì)胞胚過(guò)程中，研究者發(fā)現(xiàn)，葉片為外植體，培養(yǎng)6d時(shí)，一些表皮細(xì)胞和小表皮細(xì)胞的內(nèi)壁周圍出現(xiàn)了大量的胼胝質(zhì)，并且一直持續(xù)到大約150μm的原胚細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)才消失[29]。還有，山茶12周葉齡的葉片為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚時(shí)，在培養(yǎng)3～10d時(shí)發(fā)現(xiàn)有胼胝質(zhì)形成[30]。椰子的體胚誘導(dǎo)過(guò)程中產(chǎn)生了胼胝質(zhì)的沉積[31]，即大量β-1,3-葡聚糖大量合成。研究者普遍認(rèn)為這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是β-1,3-葡聚糖產(chǎn)生生理隔離，阻斷了細(xì)胞間信息交流。

體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中β-1,3-葡聚糖酶活性變化及其作用，在誘導(dǎo)菊苣體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中有報(bào)道。研究者在菊苣體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，監(jiān)測(cè)并確認(rèn)了1種胞外38kD β-1,3-葡聚糖酶，該酶在胚性感受態(tài)或側(cè)期是穩(wěn)定的，在表達(dá)期該酶活性顯著增加，研究者從而推測(cè)該酶是體細(xì)胞從感受態(tài)向形態(tài)建成轉(zhuǎn)變的信使分子[32]。而本研究中刺五加胚性細(xì)胞也是在形態(tài)建成期，即球形胚形成期，β-1,3-葡聚糖酶活性顯著增加，但其特性需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

刺五加從胚性愈傷組織到成熟子葉體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶2種防御性酶的活性均有顯著的變化。外切幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均在球形體細(xì)胞胚形成過(guò)程中有顯著的增高，而后隨體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育，均急劇下降，直到成熟子葉體細(xì)胞胚。相應(yīng)的β-1,3-葡聚糖含量也是在球形體細(xì)胞形成期大量合成。由此可知，這2種防御性酶活性對(duì)體細(xì)胞胚的形態(tài)建成起重要作用。而內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在整個(gè)體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育過(guò)程中均是持續(xù)增加的，該酶可能對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生不起主要作用。

在植物抗病菌方面，幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶作用往往是協(xié)同增效的[33]。例如，單獨(dú)的大豆中的幾丁質(zhì)酶對(duì)大豆疫霉菌的抑制作用不明顯，單獨(dú)的β-1，3-葡聚糖酶及其與幾丁質(zhì)酶混合，對(duì)大豆抗疫霉菌的抑制作用顯著[22]。在刺五加體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，活性變化趨勢(shì)相對(duì)一致的外切幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的作用關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

植物的體細(xì)胞胚發(fā)生是一個(gè)多因素事件，受各種內(nèi)因和外因的作用。合適的外植體在適當(dāng)?shù)耐饨缑{迫因素作用下誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。本試驗(yàn)中，該過(guò)程中的β-1,3-葡聚糖及其酶和外切幾丁質(zhì)酶均對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期——球形胚有重要的調(diào)控作用。葡聚糖可能主要對(duì)細(xì)胞起生理隔離作用，而β-1,3-葡聚糖酶和外切幾丁質(zhì)酶可能均是體細(xì)胞胚形態(tài)建成的重要胞外信號(hào)因子。

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