杜仲EuHMGS基因鑒定及生物信息學(xué)分析

王 淋，烏云塔娜，葉生晶

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；3.國(guó)家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州450003；4.國(guó)家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，湖南 長(zhǎng)沙 410014)

我國(guó)是世界上最大的橡膠消費(fèi)國(guó)，橡膠被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、航空及軍事等高科技領(lǐng)域[1]。我國(guó)對(duì)國(guó)外橡膠的需求量較大，而我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)物種杜仲是名貴的藥材，已被收錄于2010 版中國(guó)藥典[2]。不僅如此，杜仲果實(shí)、葉片、樹皮、根部均含優(yōu)質(zhì)天然橡膠——杜仲膠[3]，其中杜仲葉含膠量為1％～3％，果實(shí)含膠量為10％～12％，是世界上極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)質(zhì)天然膠資源[4]。杜仲果實(shí)的含膠量較高，利用杜仲果皮提取杜仲膠，可以降低杜仲膠提取的生產(chǎn)成本，促進(jìn)杜仲膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。杜仲膠作為多萜類化合物，其結(jié)構(gòu)與三葉橡膠順式異戊二烯不同，杜仲膠為反式異戊二烯，這就決定了杜仲膠具有獨(dú)特的橡塑二重性，被譽(yù)為高分子合金[6-7]。

萜類物質(zhì)合成主要通過(guò)以下2條途徑：一是Michel Rohmer和Duilio Arigoni等[8-9]提出位于質(zhì)體的2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP)，二是Lynen等[10-11]提出位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑(MVA)，其中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase，HMGS)是位于MVA 途徑中的一個(gè)重要的代謝酶，乙酰乙酰CoA(acetoacetyl-CoA)經(jīng)羥甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)的催化形成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，隨后在HMGCoA還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR)的作用下生成甲羥戊酸(MVA)，甲羥戊酸經(jīng)焦磷酸化和脫羧作用形成異戊烯焦磷酸IPP，從而為杜仲膠的生物合成提供通用前體[12-13]。

目前，已經(jīng)從動(dòng)物和植物的MVA途徑中系統(tǒng)分離出來(lái)HMGS基因進(jìn)行了研究[14]，而本文中利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)杜仲膠生物合成的重要靶點(diǎn)之一的HMGS基因進(jìn)行相關(guān)的預(yù)測(cè)及分析，旨在為利用基因工程技術(shù)代謝調(diào)控杜仲膠生物合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

玉米Zea mays、擬南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliae、小立碗蘚Physcomitrella patens基因組以及編碼區(qū)序列來(lái)源于phytozome(http://www.phytozome.net/search.php)數(shù)據(jù)庫(kù)，杜仲Eucommia ulmoidesOliv.數(shù)據(jù)來(lái)源于杜仲全基因組測(cè)序以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[15-16]。

1.2 分析方法

利用生物信息學(xué)軟件ExPASyProtParam、TMHMM對(duì)EuHMGS基因氨基酸殘基數(shù)、氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)的親疏水性等性質(zhì)以及蛋白的結(jié)果保守域進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析；利用PSIPRED、Swiss model預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用軟件GSDS對(duì)EuHMGS基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用PLANT CARE在線軟件預(yù)測(cè)EuHMGS基因啟動(dòng)子序列中可能存在的順式元件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HMGS基因序列分析

杜仲EuHMGS基因氨基酸序列與擬南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliaeHMGS基因家族的基因序列相比較，存在多個(gè)保守區(qū)，序列相似性達(dá)到80 ％以上(見圖1)，因此命名為EuHMGS，記為EuHMGS4[17]。

圖1 全長(zhǎng)HMGS蛋白多序列對(duì)比Fig.1 Multiple sequence alignment of the full length HMGS proteins

2.2 HMGS基因家族聚類分析

利用MEGA5.1軟件對(duì)單子葉植物玉米Zea mays、雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliae、苔蘚類小立碗蘚Physcomitrella patens的HMGS基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建了杜仲HMGS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹圖中可知，單子葉植物玉米，雙子葉植物杜仲、擬南芥、葡萄，苔蘚類小立碗蘚共分為3個(gè)主要的大分支，符合傳統(tǒng)的進(jìn)化分類結(jié)果。其中EuHMGS位于雙子葉植物的1個(gè)大分支，且與VvHMGS2的遺傳距離相對(duì)較近，說(shuō)明EuHMGS4與VvHMGS2的同源關(guān)系較近。

圖2 HMGRS蛋白的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of HMGRS proteins

2.3 HMGS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對(duì)各個(gè)植物HMGRS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如表1所示。HMGRS基因編碼氨基酸為450～470 aa；相對(duì)分子質(zhì)量為50～52kD；理論等電點(diǎn)為5～6，不同植物的HMGS基因編碼氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量以及理論等電點(diǎn)均較為一致。EuHMGS4、VvHMGS1為不穩(wěn)定的疏水蛋白；ZmHMGS3為不穩(wěn)定的親水蛋白；AtHMGS為穩(wěn)定的疏水蛋白；VvHMGS2、PpHMGS1、PpHMGS2、ZmHMGS1、ZmHMGS2為穩(wěn)定的親水蛋白。

表1 HMGS編碼蛋白質(zhì)的基本理化參數(shù)Table 1 Physical and chemical parmeters of HMGS

HMGS蛋白質(zhì)的氨基酸組成如表2所示。由表2可見，HMGS基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成大致相同，其中EuHMGS4中性疏水性氨基酸 為 Asn(N)3.3％、Ala(A)8.2％、Ile(I)4.6％、Leu(L)7.7％、Met(M)3.5％、Phe(F)4.9％、Val(V)6.0％、Trp(W)0.4％、Tyr(Y)5.3％，共43.8％；中性親水性氨基酸為Asn(N)3.3％、Cys(C)2.2％、Gln(Q)3.5％、Gly(G)6.4％、Ser(S)9.7％、Thr(T)6.2％，共31.3％；堿性氨基酸為Arg(R)3.3％、His(H)2.0％、Lys(K)7.1％，共10.4％；酸性氨基酸為Asp(D)5.3％、Glu(E)6.2％，共11.5％。

表2 HMGS蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of HMGS ％

2.4 EuHMGS基因蛋白結(jié)構(gòu)保守域預(yù)測(cè)

利用MEME在線工具分析HMGRS氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域(見圖3)，無(wú)論是單子葉植物、雙子葉植物還是苔蘚類植物，HMGRS蛋白的結(jié)構(gòu)保守域均為3個(gè)，且3個(gè)保守區(qū)均靠近蛋白的N端，其中Motif1起始位點(diǎn)為9 aa，保守序列為 ILAMEI YFPPTCVQQEAMETHDGVSKGKYTIGLGQDCM AFCTEVEDVISM；Motif2起始位點(diǎn)為72 aa，保守序列為IDPTQIGRMEVGSETVIDKSKSIKTFLMQI FEECGNTDIEGVDSTNACYG；Motif3起始位點(diǎn)為128 aa，保守序列為NCTNWVESSSWDGRYGLVV CTDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPDAPI。

圖3 HMGS基因的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domains in HMGS gene

2.5 EuHMGS基因的蛋白質(zhì)基因跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

利用在線工具TMHMM2.0對(duì)EuHMGS4氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(見圖4)。EuHMGS4蛋白無(wú)明顯跨膜區(qū)，蛋白全部位于膜外。

2.6 EuHMGS4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

根據(jù)EuHMGS4氨基酸序列，預(yù)測(cè)其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(見圖5)。結(jié)果表明，EuHMGS4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占38.05 ％，β-折疊占12.17 ％，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占49.78 ％，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

圖4 EuHMGS4蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted transmembrane region of the deduced protein of EuHMGS4 protein

圖5 EuHMGS4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary structure of the deduced EuHMGS4 protein

2.7 EuHMGS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

采用Auto mode建模方式對(duì)EuHMGS4蛋白進(jìn)行同源建模，得到了EuHMGS4蛋白的三維空間模型，如圖6所示。ExPAsy structure assessment程序評(píng)測(cè)推導(dǎo)的EuHMGS4蛋白模型QMEAN 6 得分為0.7。

2.8 EuHMGS基因的內(nèi)含子和外顯子預(yù)測(cè)及分析

將杜仲HMGS基因組序列及其對(duì)應(yīng)的完整編碼序列(coding sequence CDS)提交到GSDS在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)基因組序列特征，結(jié)果如圖7和表3所示。EuHMGS基因家族不同的基因具有不同的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量，其中EuHMGS4有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子，其中位于0相位的內(nèi)含子6個(gè)，1相位的內(nèi)含子1個(gè)，2相位的內(nèi)含子3個(gè)。

圖6 EuHMGS4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Predicted tertiary structure of the deduced EuHMGS4 protein

圖7 EuHMGS基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction on the intron and exon in EuHMGS

表3 EuHMGS4外顯子和內(nèi)含子分布序列Table 3 Distribution sequence on the intron and exon in EuHMGS4 bp

2.9 EuHMGS4基因啟動(dòng)子的順式元件作用分析

利用PLACE 和plantCARE 在線數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)EuHMGS基因啟動(dòng)子(5’UTR 2 000bp)的主要順式元件潛在的分布以及功能(見表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EuHMGS基因啟動(dòng)子含有大量基本順式作用元件TATAbox、CAATbox，除此之外，EuHMGS4啟動(dòng)子部分還還有熱脅迫(HSE)、脫落酸(ABRE)、水楊酸(TCA-element)、乙烯(ERE)等相關(guān)調(diào)控元件，這些順式作用元件均可能參與杜仲M(fèi)K基因功能以及萜類物質(zhì)代謝調(diào)控的過(guò)程。

表4 EuHMGS4基因啟動(dòng)子區(qū)順式元件作用預(yù)測(cè)Table 4 Function prediction on the cis-elements of promoter in EuHMGS4

續(xù)表1Table 1 Continuation

3 結(jié)論與討論

杜仲羥甲基戊二酰輔酶A 合酶基因(EuHMGS)是甲羥戊酸途徑(MVA)中的第1個(gè)催化酶，催化乙酰乙酰CoA 生成羥甲基戊二酰CoA，對(duì)于杜仲膠-多萜類的生物合成起著十分重要的作用[18]。序列上高度保守且功能相似的基因被稱為是同一個(gè)基因家族，生理功能的實(shí)現(xiàn)一般是通過(guò)一個(gè)家族的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)，而不是單獨(dú)的1個(gè)基因，利用基因組數(shù)據(jù)，從基因家族的角度分析代謝途徑以及基因的功能具有重要的意義[19]，根據(jù)杜仲HMGS的完整編碼框(CDS)，在杜仲基因組數(shù)據(jù)中找到唯一1個(gè)HMGS基因，目前認(rèn)為杜仲HMGS家族就只包含1個(gè)基因，而巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)HMGS也是一個(gè)小的基因家族，包括HMGS1和HMGS2[17]。對(duì)EuHMGS基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，含有HMGS蛋白的典型保守序列GNTDIEGVDSTNACYGGTA；聚類分析顯示EuHMGS與雙子葉植物遺傳距離較近，符合遺傳進(jìn)化規(guī)律。EuHMGS基因啟動(dòng)子中含有大量的脫落酸、水楊酸、茉莉酸響應(yīng)調(diào)控元件。用甲基茉莉酸和水楊酸誘導(dǎo)CaHMGS 喜樹子葉和胚軸中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同的組織中具有不同的表達(dá)調(diào)控模式[20]，因此，推測(cè)EuHMGS基因也可能具有組織特異性表達(dá)基因，而且在巴西橡膠樹中HMGS基因的mRNA和酶的活性在白天顯著高于夜間，推測(cè)HMGS可能因含有大量的光調(diào)控順式作用元件，導(dǎo)致HMGS基因的表達(dá)受到光變化的調(diào)控[21]。

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