杜仲甲羥戊酸激酶(EuMK)基因鑒定及生物信息學(xué)分析

烏云塔娜，王 淋，葉生晶

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學(xué)院，湖南 長沙410004；4.國家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，湖南 長沙 410014)

杜仲Eucommia ulmoidesOliv是我國特有的藥用樹種和膠源樹種，是第三紀(jì)孑遺植物[1-2]。杜仲作為藥材富含大量苯丙素類、黃酮類、木質(zhì)素類等活性成分，具有抗衰老、降血壓、安胎、增強(qiáng)免疫功能等多種功效[3-5]；作為源樹種，杜仲果實、葉子、樹皮等組織均含有大量的絲狀天然產(chǎn)物——杜仲膠，具有“橡膠-塑料的雙重性質(zhì)”被廣泛的應(yīng)用于橡膠、航天、醫(yī)療等多個領(lǐng)域[6]。

杜仲膠是天然橡膠順式聚異戊二烯的同分異構(gòu)體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯，聚異戊二烯是重要有機(jī)物質(zhì)，其合成是通過甲羥戊酸代謝途徑的一系列酶的酶促反應(yīng)進(jìn)行的[7]。甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase，MK)是MVA代謝途徑的限速酶之一，MK在動物中主要對控制膽固醇類生物合成其作用，而在植物中，MK主要參與類異戊二烯化合物的生物合成[8-9]。MK能將三磷酸腺苷(ATP-C)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到甲羥戊酸(mevalonate，MVA)第5位的羥基上形成甲羥戊酸-5-磷酸(mevalonate-5-phosphate，MVAP)并釋放 ADP，最終合成異戊烯焦磷酸(sopentenyl-PP，IPP)，即合成萜類物質(zhì)前體所必須的前體[8,10-11]。 本研究根據(jù)杜仲基因組數(shù)據(jù)，對杜仲MK基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為揭示EuMK基因調(diào)控杜仲萜類次生代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

文中以phytozome(http://www.phytozome.net/search.php)數(shù)據(jù)庫、杜仲全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為依據(jù)對MK基因相關(guān)分析[12-13]。

1.2 分析方法

文中利用各類生物信息學(xué)軟件對MK基因進(jìn)行在線分析。其中基因氨基酸殘基數(shù)、氨基酸組成、蛋白質(zhì)的親疏水性等性質(zhì)由 ExPASyProtParam完成；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)及親水性/疏水性的分析利用在線軟件TMHMM、ProScale 完成；蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用PSIPRED和Swiss model在線工具完成；內(nèi)含子及其外顯子結(jié)構(gòu)預(yù)測用GSDS完成；對EuMK3啟動子功能的預(yù)測由PLANT CARE在線軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 MK基因序列分析

利用Cluastl X2對EuMK與單子葉植物玉米Zea mays的ZmMK1、ZmMK2、ZmMK3， 水稻Oryza sativaL的OsMK，雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana的AtMK，葡萄Viteus vitifoliae的VvMK，苔蘚類小立碗蘚Physcomitrella patens的PpMK等MK基因家族進(jìn)行多重序列比較(見圖1)。EuMK與其它植物的MK基因存在多個保守區(qū)，序列相似性可達(dá)到80％以上，因此確定為杜仲MK基因，記為EuMK3[14]。

2.2 MK基因聚類分析

圖1 全長MK蛋白多序列對比Fig.1 Multiple sequence alignment of the full length MK proteins

利 用MEGA軟件對EuMK3、ZmMK1、ZmMK2、ZmMK3、OsMK、AtMK、VvMK、PpMK基因建了杜仲ACOTS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)。從進(jìn)化樹中可見，共分為3個主要的分支：單子葉植物玉米、水稻為1個大分支；雙子葉植物杜仲、擬南芥、葡萄為1個大分支；苔蘚類小立碗蘚為1個分支，這與傳統(tǒng)植物的進(jìn)化結(jié)果相一致。

圖2 MK蛋白的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of MK proteins

2.3 MK基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線軟件對植物MK基因的蛋白質(zhì)具體理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果見表1。植物MK編碼氨基酸為30～450 aa；理論等電為5～8；其中，EuMK3、VvMK、ZmMK1為穩(wěn)定的疏水性蛋白，而 PpMK、AtMK、ZmMK2、ZmMK3、OsMK 為穩(wěn)定的親水蛋白。

根據(jù)植物MK蛋白的氨基酸組成(見表2)可知，不用植物的HMGS基因的氨基酸組成較為不同，其中EuMK3基因中性疏水性氨基酸為Ala(A)9.7％、Asn(N)3.6％、Ile(I)6.1％、Leu(L)11.8％ 、Met(M)3.0％、Phe(F)3.0％、Val(V)7.0％、Trp(W)1.2％、Tyr(Y)11.5％， 共 占56.9％；中性親水性氨基酸為Asn(N)3.6％、Cys(C)1.5％、Gln(Q)1.2％、Gly(G)7.3％、Ser(S)11.2％、Thr(T)5.8％，共占30.6％；堿性氨基酸為Arg(R)2.7％、His(H)2.4％、Lys(K)5.5％，共占10.6％；酸性氨基酸為Asp(D)3.9％、Glu(E)7.6％，共占11.5％。

2.4 MK基因蛋白結(jié)構(gòu)保守域預(yù)測

利用MEME在線工具分析了MK氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)，見圖3。所有植物MK蛋白均含有3個結(jié)構(gòu)保守域均為，其中Motif1起始位置102 aa，保守序列為 IPEANIGLAAGVSAFLWLYISIQGYKPGNVVITSELPLGSGLGSSASFCV；Motif2起始位點為186 aa，保守序列為NKWAFEGERIIHG RPSGIDNTVSTYGYVVKFKKGQITRLHTQMPL RMLLT；Motif3起始位點為280 aa，保守序列為QSPASDDFAITEKEEKLEELMEMNQGLLQCMGV SHSSIETVLRTTLKYKL。

表1 MK編碼氨基酸的基本理化參數(shù)Table 1 Some basis physical and chemical parmeters of MK

圖3 MK基因的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Some conserved domains in MK gene

表2 MK蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of MK protein ％

2.5 EuMK3基因的蛋白質(zhì)基因跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

利用在線工具TMHMM2.0對EuMK3氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果見圖4。EuMK3蛋白無明顯跨膜區(qū)域，蛋白全部位于膜外。

圖4 EuMK3蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.4 Predicted transmembrane domain of the deduced EuMK3 protein

2.6 EuMK3基因蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

根據(jù)EuMK3氨基酸序列預(yù)測其蛋白二級結(jié)構(gòu)(見圖5)。EuMK3二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占42.42％，β-折疊占14.55％，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占43.03％，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

2.7 EuMK3基因蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過在線SWISS-MODEL中的Automated Mode進(jìn)行同源建模，推導(dǎo)EuMK3蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型(見圖6)。以蛋白模板(2r3vA)，ExPAsy structure assessment 程序評測推導(dǎo)的EuMK3蛋白模型QMEAN 6 得分為0.45，蛋白序列的相似性為32.93％。

2.8 EuMK3基因的內(nèi)含子和外顯子預(yù)測及分析

根據(jù)已知的杜仲EuMK3基因組序列及其對應(yīng)的完整編碼序列(coding sequence，CDS)，預(yù)測了EuMK3基因組結(jié)構(gòu)記憶分布情況，分別見圖7和表3。EuMK3共有4個外顯子，3個內(nèi)含子，其中位于1相位的內(nèi)含子2個，2相位的內(nèi)含子1個。

圖5 EuMK3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted secondary structure of the deduced EuMK3 protein

圖6 EuMK3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted tertiary structure of the deduced EuMK3 protein

表3 EuMK3外顯子和內(nèi)含子分布序列Table 3 Distribution sequence on the introns and exons of EuMK3 bp

2.9 EuMK3基因啟動子的順式元件作用分析

利用plantCARE 啟動子在線數(shù)據(jù)庫，預(yù)測EuMK3基因的啟動子(5’UTR 2 000 bp)的主要順式元件潛在的分布以及功能。EuMK3家族基因啟動子主要順式元件潛在的分布以及功能(見表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EuMK3基因啟動子含有大量TATAbox，CAATbox基本順式作用元件、光響應(yīng)作用元件(G-box)、防御與脅迫(TC-rich repeats)、參與生理調(diào)節(jié)(circadian)、熱脅迫(HSE)以及脫落酸(ABRE)應(yīng)答相關(guān)調(diào)控元件。

圖7 EuMK3基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測Fig.7 Prediction on introns and exons in EuMK3

3 結(jié)論與討論

甲羥戊酸(mevalonate pathway，MVA)途徑又稱細(xì)胞質(zhì)途徑，其中間體甲羥戊酸激酶屬于細(xì)胞質(zhì)酶[14]，受代謝產(chǎn)物反饋抑制調(diào)節(jié)。Champenoy[15-17]等提出植物不同階段的生長發(fā)育，MK酶活性是不同的,因此通過調(diào)控MK酶活性可以參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。Tang Wei[18]等對白松MK基因的轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行分析，白松MK基因在植株的生長發(fā)育階段均有表達(dá)，并且在根的分生組織區(qū)及花器官中表達(dá)量相對較高。葉生晶[14]提出EuMK3基因在杜仲果實和葉子中均有表達(dá)，在果實中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉子，且存在顯著的差異，且對EuMK基因熒光定量PCR的引物篩選，從而在定量PCR中檢測萜類物質(zhì)合成MVA途徑各基因的表達(dá)差異分析[19]。MK基因參與MVA途徑合成各種衍生物，對植物生長發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。

表4 EuMK3基因啟動子區(qū)順式元件作用預(yù)測Table 4 Function prediction on the cis-elements of promoters in EuMK3

通過與其它植物MK基因進(jìn)行多重序列比較，杜仲MK基因其已知植物MK基因序列相似行較高，因此確定為EuMK。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示杜仲、玉米、水稻、擬南芥、葡萄、小立碗蘚的MK基因均含有與甲羥戊酸底物結(jié)合及催化反應(yīng)有關(guān)的3結(jié)構(gòu)保守域。不同植物MK基因，具有相似的結(jié)構(gòu)保守域，說明各個植物MK基因具有相似的酶促反應(yīng)機(jī)理[20]。

EuMK3基因啟動子內(nèi)部存在著大量光誘導(dǎo)型啟動子相關(guān)元件(G-box、Box 4 、CATT-motif、GAG-motif、I-box、TCT-motif、Box I、GT1-motif)， 推測EuMK3可能是基因啟動子是一種光誘導(dǎo)型啟動子。EuMK3啟動子還含有高溫脅迫應(yīng)答相關(guān)元件HSE，即使應(yīng)答高溫等逆境脅迫[21]；乙烯應(yīng)答元件(ERE)、茉莉酸應(yīng)答相關(guān)元件(CGTCAmotif)、水楊酸酸應(yīng)答相關(guān)元件(TCA-element)，推測基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性可能受到及植物激素脫落酸、乙烯、茉莉酸等多種信號途徑的協(xié)同作用[22]。

文中首次對杜仲甲羥戊酸激酶(EuMK)進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，對EuMK基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及次生代謝物積累了分子機(jī)理，為萜類物質(zhì)-杜仲膠的合成提供了重要的理論基礎(chǔ)。

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