豬防御素與六種抗生素聯(lián)合使用的抑菌情況研究

■鄒輝琴 溫 靜 康 健 李 鋼

(四川華德生物工程有限公司，四川成都610013)

近些年來，畜產(chǎn)品中的抗生素藥物殘留問題越來越受到人們的重視，許多國家都出臺了相應(yīng)的政策來限制抗生素的添加，有的國家甚至禁止任何抗生素在飼料中的使用。此外，由于抗生素的使用不當,也造成了許多畜產(chǎn)品中耐藥菌株的產(chǎn)生，并且其出現(xiàn)的頻率已超過抗生素新藥的開發(fā)速度,給疾病的治療帶來了很大的難度。因此，在畜產(chǎn)品生產(chǎn)中需要尋找一種新的途徑來替代現(xiàn)有的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式?？咕钠毡榇嬖谟谧匀唤绲纳矬w中，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，主要分布在黏膜、免疫細胞以及免疫器官等部位[1]。抗菌肽不僅具有廣譜的殺菌作用，還具有穩(wěn)定性好、水溶性好、抗菌機理獨特、對高等動物正常細胞無害等特點[2]。關(guān)于抗菌肽和抗生素聯(lián)合抑菌的報道雖然不多，但已經(jīng)有一些相關(guān)報道證實了抗菌肽和抗生素之間存在協(xié)同抑菌效果[3]。本文利用改良的肉湯稀釋法來判定豬防御素和六種抗生素之間聯(lián)合抑菌試驗效果，為藥物合理使用問題提供了一個科學的參考依據(jù)。如果抗菌肽和抗生素的聯(lián)合抑菌存在協(xié)同作用或累加作用，不僅能更好地提高用藥效果，而且合理減少用藥劑量以避免達到毒性劑量的危險，預防及延遲抗生素耐藥性的發(fā)生，能更好地治療混合性感染，這也為尋找新的用藥方案提供了良好的鋪墊。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

豬防御素：四川華德生物工程有限公司提供，其成分為抗菌肽；抗生素：硫酸黏桿菌素（colistin sulfate）、阿散酸（arsanilic acid）、替米考星（tilmicosin）、氟苯尼考（florfenicol）、鹽酸多西環(huán)素（doxycycline hydrochloride）、阿莫西林（amoxicillin）全部購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

1.2.1 菌種

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均購置于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2.2 LB固體培養(yǎng)基

蛋白胨 10 g/l、酵母浸粉 5 g/l、NaCl 10 g/l、瓊脂15 g/l，pH值自然，121℃條件下高壓滅菌15 min。

1.2.3 LB液體培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/l、酵母浸粉5 g/l、NaCl 10 g/l，pH值自然，121℃條件下高壓滅菌15 min。

1.3 菌懸液的制備

分別將大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）劃線菌接種至LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上的一個單菌落接種至30 ml（250 ml三角瓶）LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16 h后備用。

1.4 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安LDZX-30KBS）、超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）、可見分光光度計（上海佑科721）、恒溫振蕩培養(yǎng)器（上海蘇坤SKY-200B）、隔水式培養(yǎng)箱（GNP-9080）、96孔酶標板。

1.5 試驗方法

抗菌肽的制備：精確稱取抗菌肽，配制成濃度為0.1 g/ml的溶液，在2 000 r/min下離心10 min，留上清液備用。

抗生素的制備：精確稱取抗生素，用各自對應(yīng)緩沖液將抗生素溶解配制成如表1對應(yīng)濃度，在2 000 r/min下離心10 min，留上清液備用。

表1 抗生素配制情況

由于抗菌肽的自身結(jié)構(gòu)的特殊性，所以試驗在微量肉湯稀釋法的基礎(chǔ)上加以改進，這樣能更準確地反應(yīng)試驗效果。試驗前期先用微量稀釋法把豬防御素和6種抗生素的MIC值找出來，然后確定每種藥物的稀釋度，每種藥物最高濃度為其MIC的2倍，依次對倍系列稀釋，應(yīng)用改良的肉湯稀釋法觀測6種抗生素MIC的變化。該試驗通過96孔酶標板作為細菌培養(yǎng)器皿，每排共有12孔，在每排的第1個孔和第9個孔加入270 μl含指示菌的LB營養(yǎng)液，剩余的孔全部加入含150 μl含指示菌的LB營養(yǎng)液。然后向每排的第一孔加入指定的樣品溶液30 μl（單品15 μl+對應(yīng)單品溶解緩沖液15 μl；單品15 μl+抗菌肽15 μl）。然后每排用吸頭從第一個孔開始吹打混勻后依次向下面一個孔加入150 μl混合液，直到加入每排第8個孔后，吸取第8孔150 μl混合液廢棄不要。每排的第9孔添加該排指定單品對應(yīng)的溶解緩沖液（如表1所示）30 μl作為空白對照。待添加完成后將酶標板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。第2 d取出酶標板，然后把所有孔中的混合液按照101～1066個稀釋梯度涂板計數(shù)，最后算出混合液中指示菌含量。該試驗最低抑菌濃度（MIC）定義為能抑制指示菌濃度對數(shù)約50%所對應(yīng)的樣品濃度值。FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合時MIC/A藥單測時MIC+B藥聯(lián)合時MIC/B藥單測時MIC（判斷標準：FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1為相加作用；1＜FIC≤2為無關(guān)作用；FIC＞2為拮抗作用。A藥代表豬防御素，B藥代表抗生素）[4-5]。

2 試驗結(jié)果與分析

豬防御素與六種抗生素聯(lián)合使用后對不同指示菌MIC的變化情況以及對應(yīng)的FIC指數(shù)見表2。

由于硫酸黏桿菌素主要對革蘭氏陰性菌存在抑菌作用，阿散酸、替米考星這兩種抗生素主要對革蘭氏陽性菌存在抑菌作用，所以試驗中只有鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和阿莫西林同時做了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌試驗。對于革蘭氏陰性菌而言,從MIC的變化情況來看，該試驗只有氟苯尼考和阿莫西林單獨使用時或者與豬防御素聯(lián)合其MIC沒有任何變化，替米考星的MIC降低得最多，是原來的1/8倍，這些數(shù)據(jù)表明了豬防御素與六種抗生素的聯(lián)合使用能提高大多數(shù)抗生素的抑菌效果。從不同指示菌角度來看，對于革蘭氏陰性菌而言，抗生素聯(lián)合使用時硫酸黏桿菌素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林的MIC分別為0.187 5、2.5、6.25、12 μg/ml，單獨使用時硫酸黏桿菌素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林對應(yīng)的MIC分別為0.75、10、6.25、12 μg/ml，通過FIC值的計算結(jié)果可以判斷出豬防御素與硫酸黏桿菌素、鹽酸多西環(huán)素存在協(xié)同抑菌效果，與氟苯尼考及阿莫西林聯(lián)合抑制大腸埃希氏菌時存在無關(guān)作用。對于革蘭氏陽性菌而言，豬防御素與鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、阿散酸以及阿莫西林的聯(lián)合使用所對應(yīng)的MIC分別為0.125、3.125、6.25、25、15 μg/ml，這5種抗生素單獨使用時MIC分別為0.25、6.25、50、100、30 μg/ml，通過計算FIC值可以判斷出，豬防御素與阿散酸、替米考星具有協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌的作用；此外，豬防御素與鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考及阿莫西林具有累加抑菌效果?？股厥峭ㄟ^破壞細菌細胞壁殺滅細菌的，抗菌肽是通過與細菌細胞壁結(jié)合，然后使細菌胞內(nèi)物質(zhì)溢出來殺滅細菌的，當抗菌肽和抗生素聯(lián)合抑菌時，他們可能結(jié)合了各自的作用機理，使細菌更有效地被抑制或殺滅，該試驗表明了豬防御素存在與抗生素聯(lián)合使用的潛力。

表2 豬防御素與六種抗生素聯(lián)合抑菌試驗結(jié)果

3 討論與展望

通過豬防御素與六種抗生素聯(lián)合抑菌的總體試驗結(jié)果分析可以看出，豬防御素的加入使鹽酸多西環(huán)素、替米考星、氟苯尼考、阿散酸和阿莫西林的最低抑菌濃度都有不同程度的降低，間接表明了抗菌肽的加入使這幾種某些抗生素的抑菌效果都提高了。本次研究表明了豬防御素和某些抗生素之間存在協(xié)同抑菌的作用，同時也體現(xiàn)出抗菌肽在配方飼料中的潛在應(yīng)用價值。在本次試驗研究的基礎(chǔ)上，今后還需要付出更多的時間和精力去研究不同的抗生素與不同抗菌肽聯(lián)合抑菌的相關(guān)機理，以及更進一步的動物體內(nèi)、體外試驗研究，為抗菌肽在新配方飼料方案中的大量使用奠定更加完善的試驗基礎(chǔ)。近年來有許多研究表明，抗菌肽的確對動物的常見致病菌具有強烈的抑制作用，并且對動物的生長性能也有促進作用。在養(yǎng)殖行業(yè)的疾病防御期間，如果在飼料中添加抗菌肽，能夠避免致病菌產(chǎn)生耐藥性，其使用效果穩(wěn)定，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型飼料添加劑[6-7]。在畜產(chǎn)品生產(chǎn)行業(yè)當中，尤其是在疾病治療控制期間，如果讓抗菌肽和抗生素混合合理使用，這樣不僅能更好地提高用藥效果，還可以降低因藥物過度使用造成的經(jīng)濟損失，并且合理減少用藥劑量以避免達到毒性劑量的危險，最重要的是利用抗菌肽和抗生素的合理搭配使用還可以預防及延遲抗生素耐藥性的發(fā)生，能更好地治療混合性感染。因此抗菌肽的確是尋找新的藥物使用替代方案的理想候選。