木犀草素通過蛋白激酶C途徑抑制肥胖相關(guān)的巨噬細胞極化

張 磊，鮑 斌,2，劉 健,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥豐樂種業(yè)股份有限公司，安徽 合肥 230031）

木犀草素通過蛋白激酶C途徑抑制肥胖相關(guān)的巨噬細胞極化

張 磊1，鮑 斌1,2，劉 健1,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥豐樂種業(yè)股份有限公司，安徽 合肥 230031）

目的：木犀草素（luteolin，LU）是富含于多種植物源食品中的天然黃酮類化合物，實驗旨在探討其對肥胖相關(guān)的巨噬細胞極化的影響及機制。方法：將5 周齡雄性小鼠分為3 組分別給予低脂飲食（low-fat diet，LFD）、高脂飲食（high-fat diet，HFD）和添加0.01%木犀草素的高脂飲食（HFD+0.01% LU），喂養(yǎng)12 周后利用免疫組織化學(xué)染色檢測附睪脂肪組織中巨噬細胞，并利用實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別檢測促炎性M1巨噬細胞和抗炎性M2巨噬細胞的標(biāo)記基因表達情況；體外實驗研究木犀草素對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞系RAW264.7極化的影響，利用蛋白激酶C激活劑佛波酯進行干預(yù)后，檢測促炎性細胞因子、M1和M2標(biāo)記基因的mRNA表達情況。結(jié)果：木犀草素降低了高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細胞聚集和M1型巨噬細胞標(biāo)記基因CD11c與Nos2 mRNA的表達；體外木犀草素也抑制了LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎性因子和M1型巨噬細胞標(biāo)記基因的表達，上調(diào)M2型巨噬細胞標(biāo)記基因的表達，且這些作用依賴于蛋白激酶C途徑。結(jié)論：木犀草素能夠抑制肥胖相關(guān)的巨噬細胞極化，并且通過蛋白激酶C途徑抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎性因子的表達與極化。

木犀草素；肥胖；巨噬細胞；蛋白激酶C

隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)不合理及運動缺乏，導(dǎo)致肥胖快速成為一個威脅人類健康的重要問題。肥胖過程中，隨著脂肪組織不斷擴張，促炎性細胞（如M1型巨噬細胞）大量聚集[1]，分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）、 白介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎性細胞因子[2]，而抗炎性的細胞（M2型巨噬細胞）大量減少。脂肪組織炎性細胞及炎性因子變化，使脂肪組織呈現(xiàn)炎性，繼而使機體出現(xiàn)系統(tǒng)性的慢性低等炎性[3]，從而誘發(fā)一系列相關(guān)代謝疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等[4-6]。因而，肥胖及其相關(guān)代謝疾病嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，而一些食品源的天然化合物具有潛在的減肥降糖作用，需闡明其作用機制，以期更好用于肥胖的預(yù)防和治療。

木犀草素（luteolin，LU）又叫四羥黃酮，是一種常見的天然黃酮類化合物，廣泛存在于胡蘿卜、綠茶、辣椒、芹菜、花菜、黃瓜、紫蘇葉、檸檬、白蘿卜、石榴等植物源食品中[7-8]。木犀草素具有多種生物活性，包括抗炎、抗過敏、抗肥胖、抗糖尿病、抗氧化/促氧化、抗癌、誘導(dǎo)凋亡等[7,9-10]。低劑量飲食補充木犀草素可以通過穩(wěn)定肥大細胞，抑制相關(guān)的血管生成作用，從而改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖和胰島素抵抗。飲食補充木犀草素也降低了脂肪組織中巨噬細胞及促炎性細胞因子TNF-α、MCP1和IL-6的mRNA的水平[11]。但木犀草素是否影響高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細胞極化尚不清楚。

本研究考察了高脂飲食小鼠通過飲食補充木犀草素12 周后，脂肪組織中巨噬細胞M1/M2分型變化；并體外探討了木犀草素影響巨噬細胞極化的機制，以揭示木犀草素對巨噬細胞極化中的作用及機制，為利用這一食品源的天然化合物用于肥胖預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

SPF級C57BL/6雄性4 周齡小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

木犀草素（HPLC檢測得其純度＞98%） 上海華壹生物科技有限公司；Trizol 試劑盒 日本TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 美國Invitrogen公司；實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑（SYBR Green MIX） 美國Bio-Rad公司；Mac2抗體 美國BioLegend公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA） 美國Sigma公司；無水乙醇等常規(guī)生化試劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IQ5熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；TKY-TSH組織脫水機、YB-6LF石蠟包埋機 湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；RM2235組織切片機 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)

小鼠于SPF級動物房中飼養(yǎng)，溫度維持于25 ℃，12 h/12 h光暗周期下，自由攝取食物和水。5 周齡時，參照此前關(guān)于木犀草素減肥降糖的相關(guān)研究結(jié)果[11]，將這些動物隨機分為3 組，每組8 只，即給予低脂飲食（lowfat diet，LFD，research diets D12450B，10%能量源于脂肪）的正常對照組、給予高脂飲食（high-fat diet，HFD，research diets D12451，45%能量源于脂肪）的肥胖模型組和給予添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% LU高脂飲食（HFD+ 0.01% LU）的處理組。喂養(yǎng)12 周后處死，收取附睪脂肪組織立即凍于－80 ℃。

1.3.2 免疫組織化學(xué)

組織收取后，用體積分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋及切片；切片脫蠟復(fù)水，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波修復(fù)，5 min；3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10 min；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗3×5 min；2%羊血清37 ℃條件下封閉2 h；Mac2抗體（1∶800），4 ℃孵育過夜；PBS洗3×5 min；HRP-IgG（羊抗大鼠，1∶1 000），室溫反應(yīng)2 h；PBS洗3×5 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，流水沖洗，風(fēng)干，二甲苯透明中性樹膠封片；鏡檢拍照；使用Image-Pro Plus Version 6.0軟件計算Mac2染色的巨噬細胞陽性面積[12]。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞培養(yǎng)于DMEM+10% FBS，將消化后的細胞接入48 孔板中，貼壁后用20 μmol/L木犀草素處理，對照組加入等體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），24 h后用100 ng/mL的LPS或LPS和100 mol/L蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活劑PMA刺激3 h[13]，用PBS洗兩遍，收集細胞，提取總RNA。

1.3.4 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction， real-time PCR）

組織或細胞，用Trizol試劑提取總RNA。取2 μg總RNA，按照Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書合成cDNA第一鏈。然后，利用SYBR Green MIX進行Real-time PCR，GAPDH用作內(nèi)參基因，利用Δ ΔCt法分析基因表達[12]。具體引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素可以降低飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體質(zhì)量增加和脂肪組織巨噬細胞聚集

高脂飲食中添加0.01%的木犀草素可以顯著減少小鼠體質(zhì)量的增加（圖1A）。飲食誘導(dǎo)的肥胖會導(dǎo)致巨噬細胞在脂肪組織中的大量浸潤，并形成冠狀區(qū)域。通過Mac2抗體免疫組織化學(xué)染色（圖1B），Mac2陽性面積明顯減少（圖1C）。結(jié)果表明，木犀草素飲食補充不僅具有顯著的抗肥胖作用，而且顯著降低了附睪脂肪組織中巨噬細胞的募集，與之前的報道相一致[11]。

圖1 木犀草素減少飲食誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量的增加和脂肪組織中巨噬細胞聚集Fig.1 Luteolin reduced HFD-fed mice body weight gain and macrophage infiltration in adipose tissue

2.2 木犀草素降低飲食誘導(dǎo)小鼠脂肪組織中巨噬細胞的極化

在飲食誘導(dǎo)肥胖產(chǎn)生過程中，脂肪細胞的增殖和體積增大使脂肪組織不斷擴張，募集大量的巨噬細胞浸潤，使M1/M2型巨噬細胞的比例不斷提高，引起脂肪組織慢性低度炎性的發(fā)生。通過Real-time PCR檢測脂肪組織中巨噬細胞分型標(biāo)記基因mRNA表達，發(fā)現(xiàn)木犀草素降低高脂飲食誘導(dǎo)小鼠脂肪組織中M1型巨噬細胞標(biāo)記基因CD11c和Nos2 mRNA表達（圖2a、2b）；沒有改變M2型巨噬細胞標(biāo)記基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表達（圖2c、2d）。M1型巨噬細胞的減少，降低了高脂飲食引起的M1/M2型巨噬細胞的比例，改善了脂肪組織中的炎性。

圖2 木犀草素降低脂肪組織中巨噬細胞的極化Fig.2 Luteolin depressed macrophage polarization in adipose tissue of HFD-fed mice

2.3 木犀草素抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的極化

為了進一步驗證木犀草素對巨噬細胞極化的影響，體外利用LPS可以誘導(dǎo)巨噬細胞系RAW264.7向M1型巨噬細胞極化[13-14]。RAW264.7經(jīng)LPS刺激后，炎性因子TNF-α和MCP1 mRNA的表達顯著升高；M1型巨噬細胞標(biāo)記基因CD11c和Nos2 mRNA表達顯著升高；而M2型巨噬細胞標(biāo)記基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表達顯著下降。而添加木犀草素，則可以顯著改善LPS刺激引起的上述改變，與單獨LPS刺激相比，TNF-α和MCP1的表達顯著降低（圖3a、3b），CD11c和Nos2 mRNA表達顯著降低（圖3c、3d），Mgl2和Chi3l3 mRNA表達顯著升高（圖3e、3f）。木犀草素可以顯著改善LPS刺激后RAW264.7巨噬細胞的極化及炎性。

圖3 在體外木犀草素抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的極化Fig.3 Luteolin suppressed RAW264.7 macrophage polarization in vitro

2.4 木犀草素抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的極化依賴于蛋白激酶C途徑

木犀草素抑制了LPS引起的巨噬細胞極化及炎性，但是木犀草素通過何條信號途徑發(fā)揮作用仍不清楚。蛋白激酶C是一種Ca2+和磷脂依賴性激酶，通過催化多種靶蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)，完成細胞對外源性信號的應(yīng)答[15]，參與了LPS通過TLR4介導(dǎo)NF-κB的激活轉(zhuǎn)錄炎性因子的表達[14]。因此，利用RAW264.7巨噬細胞系，研究了木犀草素發(fā)揮作用是否依賴了蛋白激酶C途徑。添加蛋白激酶C的激活劑（PMA），讓TLR4的下游處于持續(xù)激活狀態(tài)，然后加入木犀草素觀察其對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7的極化及炎性的影響。由圖4可知，PMA可以阻斷木犀草素的作用。加入PMA后，木犀草素不再能夠降低LPS刺激下炎性因子TNF-α、MCP1（圖4a、4b）和M1型巨噬細胞標(biāo)記基因CD11c、Nos2的mRNA表達（圖4c、4d）；木犀草素也不再能夠升高LPS刺激下M2型巨噬細胞標(biāo)記基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表達（圖4e、4f）。

圖4 木犀草素抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的極化依賴蛋白激酶C途徑CFig.4 Suppression of luteolin on RAW264.7 macrophage polarization through PKC pathway

3 討 論

木犀草素，作為一種廣泛存在于各種植物源食品中的天然黃酮化合物，具有多種生物活性，是潛在具備減肥降糖作用的天然化合物[16]。已有研究報道，木犀草素可以通過穩(wěn)定肥大細胞抑制血管的生成，改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖及胰島素抵抗[11,17]。木犀草素還可以直接作用于巨噬細胞，降低促炎性細胞因子的表達[9,18]。但是，木犀草素對巨噬細胞的極化的影響尚不清晰。本研究通過在飲食中添加木犀草素，降低了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠體質(zhì)量的增加和脂肪組織巨噬細胞的浸潤。同時，木犀草素也抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細胞M1極化；M2型巨噬細胞的數(shù)量沒有改變，引起M1/M2比例的降低，最終改善了高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪組織慢性炎性。在肥胖相關(guān)的慢性低度炎性發(fā)展過程中，脂肪組織中巨噬細胞的浸潤與極化是產(chǎn)生炎性的重要原因[3]，所以降低脂肪組織中巨噬細胞的浸潤與極化，可以改善肥胖相關(guān)代謝疾病的產(chǎn)生。

為進一步查明木犀草素影響巨噬細胞極化的作用機制，本研究考察了，在LPS刺激下，木犀草素處理對巨噬細胞系RAW264.7向M1型巨噬細胞極化及炎性變化的影響。結(jié)果顯示，木犀草素處理可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎性因子和M1型巨噬細胞標(biāo)記基因表達，升高M2型巨噬細胞標(biāo)記基因表達，改變了M1/M2的比例，降低了細胞的炎性。鑒于蛋白激酶C在LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎性與極化調(diào)控中起重要作用[19-20]，本研究進一步研究了木犀草素對這一信號途徑的影響。結(jié)果顯示，添加蛋白激酶C激活劑PMA，可以阻斷木犀草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞促炎性細胞因子表達和極化的影響，說明木犀草素的改變巨噬細胞極化依賴于蛋白激酶C途徑，但具體的作用機制有待進一步研究。這些結(jié)果說明，木犀草素在體外可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞的極化與促炎性因子表達，在體內(nèi)可以抑制高脂飲食所導(dǎo)致的脂肪組織炎性的產(chǎn)生。此前的研究已報道[17]，穩(wěn)定肥大細胞可以抑制巨噬細胞的脂肪組織浸潤與極化。但是，本實驗所發(fā)現(xiàn)的上述對巨噬細胞炎性和極化的抑制作用是否是由于木犀草素的肥大細胞穩(wěn)定特性，仍有待進一步的研究證明。上述機制的闡明，為食品源木犀草素的減肥降糖作用增添了新的證據(jù)，為推廣富含木犀草素的的植物源食品，改善高熱量飲食所導(dǎo)致的肥胖及其相關(guān)代謝綜合癥奠定了理論基礎(chǔ)。

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Luteolin Inhibits Obesity-Associated Adipose Tissue Macrophage Polarization through Protein Kinase C (PKC) Pathway

ZHANG Lei1, BAO Bin1,2, LIU Jian1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Hefei Fengle Seed Co. Ltd., Hefei 230031, China)

Objective: Luteolin is a natural flavonoid abundant in many edible plants. The aim of this study is to explore the effect of luteolin (LU) on obesity-associated adipose tissue macrophage (ATM) polarization and its underlying mechanisms. Methods: Five-week-old C57BL/6 mice were fed with low-fat diet (LFD), high-fat diet (HFD), or HFD with 0.0l% luteolin (HFD+0.0l% LU) for 12 weeks, respectively. Macrophage infiltration and polarization were detected by immunohistochemical staining or real-time PCR in epididymal adipose tissue. The in vitro effect of luteolin on RAW264.7 macrophage inflammation and polarization in lipopolysaccharide (LPS) and/or PMA-stimulated conditions was also explored. The expression levels of proinflammatory cytokines and M1/M2 marker genes were detected by real-time PCR. Results: Dietary luteolin reduced HFD-induced ATM infiltration and mRNA levels of M1 macrophage marker genes. In LPS-stimulated conditions, luteolin inhibited the expression of proinflammatory cytokines and M1 marker genes in RAW264.7 macrophages. In contrast, the expression of M2 marker genes was enhanced by luteolin. However, these effects of luteolin were aborted by protein kinase C (PKC) activator phorbol myristate acetate (PMA). Conclusion: Luteolin can inhibit obesityassociated ATM and RAW264.7 macrophage polarization in LPS stimulated-conditions through protein kinase C pathway.

luteolin; obesity; macrophage; protein kinase C

R151.4

A

1002-6630（2014）13-0186-06

10.7506/spkx1002-6630-201413036

2014-05-26

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171315）；安徽省自然科學(xué)基金項目（1408085QC48）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（2013M541817）

張磊（1987—），男，博士研究生，研究方向為肥胖分子機理及減肥功能食品。E-mail：shamohai87@hotmail.com

*通信作者：劉?。?970—），男，教授，博士，研究方向為肥胖分子機理及減肥功能食品。E-mail：Liujian509@hfut.edu.cn