UPLC-ESI-MS-MS結(jié)合QuEChERS同時(shí)測定柑橘中的4 種真菌毒素

史文景，趙其陽，焦必寧,3,*

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術(shù)研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712）

UPLC-ESI-MS-MS結(jié)合QuEChERS同時(shí)測定柑橘中的4 種真菌毒素

史文景1,2，趙其陽1，焦必寧1,2,3,*

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術(shù)研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712）

建立同時(shí)檢測柑橘中鏈格孢酚甲基乙醚、交鏈孢酚、騰毒素和橘青霉素4 種真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法。待測樣品經(jīng)乙腈提取，無水MgSO4和NaCl脫水鹽析，C18鍵合相分散萃取凈化，以ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱為分離柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫，在電噴霧離 子源電離、多反應(yīng)監(jiān)測模式條件下進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。該方法在5.0～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）不小于0.992 7，檢出限為0.2～0.7 μg/kg。3 個(gè)不同加標(biāo)水平的平均回收率為78.0%～103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～10.6%。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，適用于柑橘中4 種真菌毒素殘留的快速確證檢測。

超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜；QuEChERS；柑橘；真菌毒素

鏈格孢屬褐斑病和綠霉病是柑橘貯藏期間的常發(fā)病害，分別是由互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）[1]和指狀青霉（Penicillium digitatum）[2]引起的?；ジ艚绘滄呙鼓墚a(chǎn)生騰毒素（tentoxin，TEN）、鏈格孢酚甲基乙醚（aletrnariol monomethyl ether，AME）和鏈格孢酚（alternario l，AOH）等多種鏈格孢霉毒素[3-4]，指狀青霉是橘青霉素（citrinin，CIT）的重要產(chǎn)生菌之一[5]。這些真菌毒素具有致癌性、細(xì)胞毒性、基因毒性等毒性作用[6-8]，對(duì)人體健康有潛在的危害。但是，目前我國現(xiàn)行的食品中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)中并未包括鏈格孢霉毒素和橘青霉素[9]，并且我國尚未制定柑橘類水果中真菌毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，建立柑橘類水果中快速、靈敏、準(zhǔn)確的真菌毒素檢測方法具有十分重要的意義。

真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法[10]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLCMS-MS）法[12-14]、毛細(xì)管電泳[15]和免疫學(xué)檢測方法[16]等。江濤等[10]利用薄層色譜法測定大米中的橘青霉素，檢出限高于30 μg/kg，靈敏度低。陳月萌等[11]利用高效液相色譜-熒光檢測法測定水果中的3 種鏈格孢霉毒素，方法平均回收率均在78.2%～103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.6%，檢出限為2.0～8.0 μg/kg。還有研究者[12-14]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜法分別測定了蘋果汁、橙汁和番茄中的鏈格孢霉毒素，檢出限為0.1～4.0 μg/kg、靈敏度高，前處理步驟分別采用PS DVB固相萃取柱、凝膠色譜和Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化，凈化效果好，但操作較為繁瑣、耗時(shí)，且成本高。杜建中等[15]利用毛細(xì)管電泳測定霉變食品中的橘青霉素，微量、快速、高效，檢出限為2.1 μg/mL，靈敏度低。但目前還未見有相關(guān)同時(shí)檢測柑橘水果中的鏈格孢霉毒素和橘青霉素的方法報(bào)道。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）方法具有回收率高、試劑用量少、簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)[17-19]，適用于大量樣品的檢測。超高效液相色譜-質(zhì)譜法可同時(shí)用于定性和定量分析，具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[20-22]。本實(shí)驗(yàn)以改進(jìn)的QuEChERS方法結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS-MS）法同時(shí)測定柑橘中的騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素4 種真菌毒素，方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，適用于柑橘類水果中4 種真菌毒素的確證檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素標(biāo)準(zhǔn)品 新加坡Pribolab公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、乙腈和甲醇（色譜純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；無水硫酸鎂（分析純） 江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；氯化鈉（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18鍵合相 大連思譜精工有限公司；甲酸（分析純） 重慶川東化工有限公司。

Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-質(zhì)譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；KS260搖床、Vortex Genius 3渦旋混合器德國IKA公司；3K15離心機(jī) 德國Sigma公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本三洋公司；Milli-Q A10超純水器 美國Millipore公司；0.22 μm有機(jī)濾膜 中國捷盛依科科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL，得到40 mg/L的真菌毒素母液，置于－50 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別配制2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L和0.05 mg/L的4種真菌毒素的混合溶液，置于－50 ℃保存。

基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：以不含真菌毒素的柑橘果實(shí)為材料，利用本實(shí)驗(yàn)前處理方法分別制備柑橘果皮、全果和果肉的基質(zhì)空白溶液。用基質(zhì)空白溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作液按相同比例稀釋至0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L和0.005 mg/L，分別得到柑橘果皮、全果和果肉基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品提取和凈化

準(zhǔn)確稱取柑橘全果、果肉和果皮樣品各10 g（準(zhǔn)確至0.01 g），加入乙腈10 mL（準(zhǔn)確至0.01 mL），搖床振蕩提取30 min（300 r/min）；加入3.0 g無水MgSO4和1.0 g NaCl，劇烈振蕩1 min，離心（4 000 r/min，5 min）；取上清液2.0 mL，加入30 mg C18，渦旋3 min，離心（4 000 r/min，5 min）；0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，UPLC-ESI-MS-MS分析。

1.2.3 儀器實(shí)驗(yàn)條件

1.2.3.1 UPLC條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相體系為0.1%甲酸溶液和乙腈；梯度洗脫程序：在0～5 min，乙腈由20%線性遞增至80%，保持2 min，在0.1 min內(nèi)恢復(fù)至20%，并保持1 min；進(jìn)樣量：3 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式（ESI＋）和負(fù)離子模式（ESI－）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度360 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，碰撞氣流量0.2 L/min，錐孔反吹氣流量50 L/h。4種真菌毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4 種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測定參數(shù)Table1 MS-MS parameters for four mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 改進(jìn)QuEChERS方法

2.1.1 除水劑用量的優(yōu)化

QuEChERS方法以無水MgSO4為除水劑，并結(jié)合NaC l的鹽析作用，除去樣品中的水分和雜質(zhì)，使目標(biāo)物能夠充分溶解在有機(jī)相中。本實(shí)驗(yàn)考察了無水MgSO4用量對(duì)添加回收率的影響，如圖1所示，當(dāng)無水MgSO4的用量為2.0～3.0 g時(shí)，4種真菌毒素的添加回收率均上升，并且在無水MgSO4的用量為3.0 g時(shí)，4種真菌毒素的添加回收率均較理想；在3.0～5.0 g范圍內(nèi)，鏈格孢酚和橘青霉素的添加回收率降低，騰毒素和鏈格孢酚甲基乙醚的添加回收率變化不大。因此，選取無水MgSO4的用量為3.0 g。

圖1 無水MgSO4用量對(duì)4 種真菌毒素回收率的影響（加標(biāo)量0.1 mg/kg）Fig.1 Effect of anhydrous MgSO4amount on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.2 凈化劑及用量優(yōu)化

GCB、PSA、C18是QuEChERS方法常用的凈化劑，本實(shí)驗(yàn)考察3種凈化劑及其用量對(duì)4 種真菌毒素添加回收率的影響。GCB主要用于凈化色素含量較高的樣品，以GCB作為凈化劑，4 種真菌毒素的添加回收率均低于70%；以PSA作為凈化劑，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚和鏈格孢酚 均能得到較好的添加回收率，但是橘青霉素添加回收率低，并且隨著PSA用量增加，回收率下降；以C18作為凈化劑，4 種真菌毒素均能得到良好的添加回收率。如圖2所示，當(dāng)C18用量為30 mg時(shí)，4 種真菌毒素的添加回收率最為理想。

圖2 C18用量對(duì)4 種真菌毒素回收率的影響（加標(biāo)量0.1 mg/kg）Fig.2 Effect of C18dose on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.1.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以乙腈作為提取劑，以振蕩提取作為提取方法，考察提取時(shí)間對(duì)于4 種真菌毒素添加回收率的影響。如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間為15～30 min時(shí)，4 種真菌毒素的添加回收率均有所提高，其中鏈格孢酚甲基乙醚最為明顯；當(dāng)提取時(shí)間大于30 min，4 種毒素的添加回收率的提高并不明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)確定提取時(shí)間為30 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)4 種真菌毒素回收率的影響（加標(biāo)量0.1 mg/kg）Fig.3 Effect of extraction time on the recoveries of four mycotoxins (at spiked level 0.1 mg/kg)

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了水-甲醇、水-乙腈、甲酸溶液-甲醇、甲酸溶液-乙腈4 種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明以甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相體系，4 種真菌毒素的離子信號(hào)值增強(qiáng)，且峰形得到明顯改善。確定流動(dòng)相體系為甲酸溶液-乙腈后，進(jìn)一步優(yōu)化了甲酸的用量，實(shí)驗(yàn)表明甲酸加入量為0.1%時(shí)，出峰效果最佳。

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，分別在ESI＋模式和ESI－模式下進(jìn)行全掃描，確定騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚和鏈格孢酚在負(fù)離子模式下的靈敏度更高，確定3 種真菌毒素的母離子分別是m/z 413.32、m/z 271.02和m/z 257.02；橘青霉素在正離子模式下的靈敏度高于負(fù)離子模式，確定其母離子為m/z 250.7。通過對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、碰撞電壓、碰撞壓力等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，每一種真菌毒素均產(chǎn)生多個(gè)子離子，并從中各篩選出豐度強(qiáng)、干擾小的兩對(duì)離子對(duì)作為監(jiān)測離子對(duì)，以豐度最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子對(duì)（表1），圖4為1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中4 種真菌毒素的MRM子離子質(zhì)譜圖。

圖4 騰毒素、鏈格孢酚、鏈格孢酚甲基乙醚和橘青霉素的MRM子離子質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of tentoxin, alternariol methyl ether, alternariol, and citrinin

2.3 方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限

利用UPLC-ESI-MS-MS測定復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響方法的準(zhǔn)確性，降低方法的靈敏度[23]?；|(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使得標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的離子化條件相同，從而減弱基質(zhì)效應(yīng)，因此采用基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素均在5.0～200 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R2不小于0.992 7。以3 倍信噪比（RSN）計(jì)，騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素的檢出限均低于0.2～0.7 μg/kg。

表2 4 種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和檢出限Table2 Liner ranges, linear equations, correlation coefficients (R2) and limits of detection (LODs) for four mycotoxins

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度

按1.2.2節(jié)方法分別制備果皮、果肉和全果樣品，添加10、50、100 μg/kg 3 個(gè)水平的4 種真菌毒素，每個(gè)添加水平重復(fù)測定5 次。4 種目標(biāo)物質(zhì)在3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為78.0%～103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.6%～10.6%（表3），具有較高的回收率和精密度。

表3 柑橘果皮、果肉以及全果中4 種真菌毒素的添加回收率和精密度（n=5）Table3 Recovery rates and precision for four spiked mycotoxins in citrus peel, pulp and whole fruits (n=5)

2.3.3 實(shí)際樣品測定

從冷庫貯藏果中抽取100 個(gè)柑橘樣品，按1.2.2節(jié)方法分別制備果皮、果肉和全果，UPLC-MS-MS分析（圖5）。由表4可知，15 份柑橘果皮樣品呈陽性，4 種真菌毒素含量在1.0～26.6 μg/kg之間，檢出率在5.0%～11.0%之間；7 份全果樣品呈陽性，4 種真菌毒素的含量在1.5～8.3 μg/kg之間，檢出率在1.0%～5.0%之間；3 份果肉樣品被檢測出鏈格孢酚甲基乙醚，含量在2.5～6.0 μg/kg之間，其他3 種真菌毒素均未被檢出。

圖5 柑橘果肉（a）、全果（b）和果皮（c）實(shí)際樣品的總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatograms of citrus pulp (a), whole fruit (b) and peel (c)

表4 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果Table4 Contents of four mycotoxins in real samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-ESI-MS-MS結(jié)合改進(jìn)的QuEChERS方法快速測定柑橘中騰毒素、鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢酚和橘青霉素4 種真菌毒素的方法，方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，檢出限低，重復(fù)性好，能夠在8 min內(nèi)完成檢測。利用該方法檢測柑橘中的4 種真菌毒素，平均回收率為78.0%～103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～10.6%，符合真菌毒素檢測的要求，適用于柑橘類樣品的快速確證檢測。

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Simultaneous Determination of Four Mycotoxins in Citrus Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Combined with Modified QuEChERS

SHI Wen-jing1,2, ZHAO Qi-yang1, JIAO Bi-ning1,2,3,*
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Citrus Products, Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China)

A method was developed for simultaneous determination of four mycotoxins (aletrnariol monomethyl ether, tentoxin, alternariol, and citrinin) in citrus fruits using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with optimized QuEChERS. Samples were extracted with acetonitrile, salted out with anhydrous MgSO4and NaCl, cleaned up with C18and then analyzed using UPLC-MS-MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization. The separation of the target mycotoxins was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18liquid chromatography column through gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution and the matrix-matched external standard calibration was used for quantitation. This method had a good linearity in the concentration range of 5.0-200 μg/L with correlation coefficients (R2) more than 0.992 7, and the limit of detection of the established method was in the range of 0.2-0.7 μg/kg. The average recoveries of the four mycotoxins in different matrixes (citrus pulp, peel and whole fruit) at three spiked levels ranged from 78.0% to 103.3%, with relative standard deviations (RSDs) of 2.6%-10.6%. This method is simple, quick, accurate, sensitive, and suitable for the quick confirmation and quantitative determination of the four mycotoxins in citrus fruits.

ultra-high liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; QuEChERS; citrus; mycotoxins

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0170-05

10.7506/spkx1002-6630-201420034

2013-11-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑桔）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-27）；“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAD47B07；2007BADB7B04）；2014年國家柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2014003）；農(nóng)業(yè)部無公害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測項(xiàng)目

史文景（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楣窢I養(yǎng)與安全。E-mail：shiwenjing001@126.com

*通信作者：焦必寧（1964—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楣哔|(zhì)量安全及檢測技術(shù)。E-mail：bljiao@tom.com