加壓毛細(xì)管電色譜-紫外法檢測復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素

鄭 署，施文君，王曉曦，李 靜，谷 雪，閆 超,*

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

加壓毛細(xì)管電色譜-紫外法檢測復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素

鄭 署1，施文君1，王曉曦1，李 靜2，谷 雪1，閆 超1,*

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

采用反相加壓毛細(xì)管電色譜-紫外檢測，建立一種高效、簡便、快速的脂溶性維生素分析方法，并用于復(fù)合維生素片中脂溶性維生素的檢測。使用C18反相毛細(xì)管色譜柱，以含0.05%三氟乙酸的95%甲醇溶液（pH 3.3）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，泵總流速為0.2 mL/min，分離電壓為15 kV，并針對脂溶性維生素樣品個(gè)體間紫外吸收波長差別較大的問題，采用波長時(shí)間程序進(jìn)行檢測。VA、VD3、VE、VK3四種脂溶性維生素可在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離。各組分的最低檢出限（RSN=3）分別為1.5、3.0、15、1.5 μg/mL，線性關(guān)系良好，樣品加標(biāo)回收率在90.0%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～5.46%。將所建立方法應(yīng)用于維生素片樣品分析，取得了良好的分析結(jié)果。該方法簡單方便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠。

加壓毛細(xì)管電色譜；紫外檢測；脂溶性維生素；復(fù)合維生素片

維生素是人和動(dòng)物維持正常的生理功能而必需從食物中獲得的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。維生素是個(gè)龐大的家族，目前所知的維生素就有幾十種，大致可分為脂溶性和水溶性兩大類。脂溶性維生素主要包括VA、VD、VE和 VK。VA和VD主要儲(chǔ)存于肝臟，VE主要存于體內(nèi)的脂肪組織，而VK儲(chǔ)存較少。它們是人體所需要的微量營養(yǎng)成分，對人體的生理活動(dòng)有非常重要的作用。目前，脂溶性維生素的檢測方法有膠束電動(dòng)色譜法[1]、高效液相色譜法[2-3]、薄層色譜法[4]、熒光法[5-7]、電色譜法[8]等，其中高效液相色譜法是應(yīng)用最多、最廣的方法，但同時(shí)測定脂溶性維生素（VA、VD、VE、VK）的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且常規(guī)液相色譜法的分離時(shí)間長，試劑樣品耗費(fèi)多。因此，建立一種更為簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的多組分脂溶性維生素分離檢測的方法則成為必然趨勢。

加壓毛細(xì)管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）是近年發(fā)展起來的一種新興微分離技術(shù)，同時(shí)具備高效液相色譜的高選擇性和毛細(xì)管電泳的高柱效。其特征是電滲流和壓力流同時(shí)驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，由于在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)的不同以及電泳淌度的差異，樣品被快速、高效地分離。pCEC系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，特點(diǎn)突出，通用性和穩(wěn)定性好，并可與多種檢測技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析[9]、藥物分析[10-13]、食品安全檢測[14]、生命科學(xué)[15-16]等研究領(lǐng)域。

本研究基于pCEC微分離平臺(tái)，建立了波長時(shí)間程序檢測維生素片中脂溶性VA、VD3、VE、VK3的多組分同時(shí)分離檢測的加壓毛細(xì)管電色譜法，該方法簡單快速、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠，可為常用脂溶性維生素的分離檢測提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試品購自國大藥房有限公司。

乙腈、甲醇（均為色譜純）和磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為二次蒸餾水；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（分析純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；脂溶性維生素對照品：VA（批號(hào)：36952，純度＞98%）、VD3（批號(hào)：38718，純度＞98%） 阿拉丁試劑公司；D-α-VE（純度＞99%） 日本Tokyo Chemistry Industry公司；VK3（純度＞98%） 百靈威科技有限公司。

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀 美國Unimicro Technologies公司；KQ2200B型超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；PB-10 pH計(jì) 北京賽多利斯儀器有限公司；FA1004電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；AS5150A超聲波清洗機(jī) 天津奧特賽思斯儀器有限公司；HP-01無油真空泵 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；C18毛細(xì)管電色譜柱 蘇州環(huán)球色譜有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

4 種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取VA、VD3、VK3、VE各100 mg，置于不同燒杯中，用適量甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別移入10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，低溫避光保存。

4 種脂溶性維生素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：用甲醇溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為5、10、50 、100、300、500、1、2 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

在避光操作條件下精密稱取供試品3 g，研磨均勻后置于100 mL燒杯中，加入適量甲醇，超聲提取15 min；經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中；重復(fù)上述提取操作兩次，合并濾液，搖勻后以甲醇定容至刻度，低溫避光保存。

1.2.3 pCEC-UV色譜條件

色譜柱：C18毛細(xì)管電色譜柱（100 mm×100 μm，3 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（含0.05% TFA，pH 3.3）（95∶5，V/V）；泵總流速：0.2 mL/min；檢測波長時(shí)間程序見表1；進(jìn)樣量1 μL（分流比1∶300）；電壓施加在毛細(xì)管色譜柱的出口端，進(jìn)口端接地。

表1 波長時(shí)間程序Table1 Detection wavelength-time program for four fat-soluble vitamins

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

脂溶性維生素的性質(zhì)不穩(wěn)定，酸堿、氧氣、光和熱均可使其分解變質(zhì)，為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度，在完成樣品制備后，應(yīng)迅速制備成分析試樣進(jìn)行色譜分析。測定脂溶性維生素常用的樣品前處理方法有固相萃取法[17]、皂化法[18-19]及溶劑直接萃取法[20]。其中皂化法分為加熱回流皂化法和室溫過夜皂化法，前者需要高溫環(huán)境，對脂溶性維生素造成破壞，而后者需要較長的處理時(shí)間，一定程度上會(huì)造成脂溶性維生素變質(zhì)，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度；而固相萃取法避免了皂化法的上述缺點(diǎn)，但是使用成本較高，操作也較為繁瑣；綜合考慮，選擇溶劑直接萃取法作為脂溶性維生素樣品的前處理方法，該方法簡便、快捷、成本低、準(zhǔn)確度高。

圖1 4種脂溶性維生素對照品的pCEC分離色譜圖Fig.1 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins

2.2 pCEC-UV色譜條件的選擇與優(yōu)化

本研究基于加壓毛細(xì)管電色譜平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)中主要考察了波長時(shí)間程序、流動(dòng)相組成、分離電壓、緩沖鹽等色譜條件對4 種脂溶性維生素分離的影響，并進(jìn)行了條件優(yōu)化，建立4 種脂溶性維生素的pCEC-UV快速分離檢測的方法，見圖1。

2.2.1 波長時(shí)間程序

表2 4 種脂溶性維生素的最大吸收波長Table2 Maximum absorption wavelengths of four fat-soluble vitamins

4 種脂溶性維生素的紫外最大吸收波長（表2）差別較大，實(shí)驗(yàn)中嘗試選擇280 nm作為單一檢測波長時(shí)，發(fā)現(xiàn)VA和VE的信噪比較低；而選擇295 nm作為單一檢測波長時(shí)，VK3的信噪比又變得很低。為了提高檢測靈敏度，本研究使用波長時(shí)間程序（表1）進(jìn)行檢測，結(jié)果表明各脂溶性維生素樣品均可得到滿意的信噪比。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)對樣品分離的影響，見圖2，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系條件下，VD3的信噪比較低，選擇甲醇-水體系可得到更好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)最終確定以甲醇-水（95∶5，V/V）作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫。

圖2 脂溶性維生素在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖Fig.2 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins under different mobile phase conditions

2.2.3 流動(dòng)相中緩沖鹽的選擇與優(yōu)化

加壓毛細(xì)管電色譜分離體系中需要添加可導(dǎo)電的酸堿或者緩沖鹽溶液，以保證施加電壓后形成穩(wěn)定的電場及電滲流，實(shí)驗(yàn)中分別考察TFA、磷酸鹽以及Tris-HCl緩沖體系對分離的影響。結(jié)果表明，磷酸鹽以及Tris-HCl緩沖溶液體系下，加電后的電流值過高，引起的焦耳熱效應(yīng)，造成基線噪聲較大；而添加TFA后，可有效改善色譜峰形，在確保電滲流產(chǎn)生的前提下，還可以避免維生素在反相色譜柱上的吸附。同時(shí)注意到，添加過量的TFA會(huì)造成流動(dòng)相體系的pH值過低，不利于電滲流的產(chǎn)生，所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇TFA體積分?jǐn)?shù)為0.05%（pH 3.3，V/V）。

2.2.4 分離電壓的影響

電壓是pCEC實(shí)驗(yàn)條件中的一個(gè)重要參數(shù)，施加不同的電壓對樣品的分離會(huì)產(chǎn)生不同的影響，在本研究中主要是對分離速度和分辨度的影響。實(shí)驗(yàn)中分別考察了電壓為0、5、10、15 kV和20 kV時(shí)，4 種脂溶性維生素的分離情況。由圖3可見，伴隨著施加在毛細(xì)管出口端負(fù)電壓的增加，電滲流方向和壓力流一致，且一直呈增大趨勢，整體分析速度明顯提高。但當(dāng)分離電壓超過15 kV后，過大的電壓造成電流值急劇上升，焦耳熱效應(yīng)不但使得基線波動(dòng)增大，且造成了VD3的信噪比下降。

圖3 脂溶性維生素在不同電壓條件下的色譜圖Fig.3 Effect of applied voltage on pCEC separation of four fat-soluble vitamins

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)VA對照品存在雜質(zhì)，在不加電的情況下兩者無法實(shí)現(xiàn)基線分離，隨著分離電壓的增大，分辨度增大（表3）。在考慮不影響定量的基礎(chǔ)上，綜合各方面因素，本實(shí)驗(yàn)最終選擇15 kV作為分離電壓。

表3 不同電壓條件下VA和雜質(zhì)的分辨度Table3 Resolution of vitamin A and impurities at different voltages

2.3 分析方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍和檢出限

表4 4種脂溶性維生素的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table4 Regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges, limits of detection and limits of quantitation for four fat-soluble vitamins

以1.2.1節(jié)配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，以4 種脂溶性維生素的色譜峰面積（Y）與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度X/（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，以信噪比RSN=10計(jì)算定量限，RSN=3計(jì)算檢出限，結(jié)果見表4。4 種脂溶性維生素的線性范圍均超過兩個(gè)數(shù)量級(jí)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度

取復(fù)方維生素片樣品3 g，在線性范圍內(nèi)，添加3 個(gè)不同水平的維生素標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.2節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行處理后進(jìn)行pCEC分析，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣3 次，結(jié)果見表5。該方法加標(biāo)回收率在90.0%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～5.46%，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表5 復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素的加標(biāo)量、回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table5 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of four fatsoluble vitamins in spiked vitamin tablets (n=3)

2.4 復(fù)方維生素片的分析

準(zhǔn)確稱取復(fù)合維生素片3 g，按照1.2.2節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行處理后，按照1.2.3節(jié)的pCEC色譜條件進(jìn)行分析，見圖4。

圖4 復(fù)合維生素片樣品中4種脂溶性維生素的pCEC色譜圖Fig.4 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins in vitamin tablets

該品牌復(fù)方維生素片產(chǎn)品所標(biāo)注的脂溶性VA、VD3、VK3和VE均被準(zhǔn)確的檢出，根據(jù)線性方程計(jì)算其含量見表6。

表6 復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素的含量Table6 Contents of four fat-soluble vitamins in vitamin tablets

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以pCEC為平臺(tái)，在5 min內(nèi)可以完成常用4 種脂溶性維生素的同時(shí)測定。該方法簡單方便，準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，借助pCEC電滲流和壓力流的雙重推動(dòng)力，顯著提高了分析速度和分離效能。且pCEC作為一種微分離技術(shù)，實(shí)際分析流速只在微升級(jí)甚至納升級(jí)，大大節(jié)省了檢測成本，具有實(shí)用推廣價(jià)值。

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Determination of Four Fat-Soluble Vitamins in Vitamin Tablets by Pressurized Capillary Electrochromatography with UV Detection

ZHENG Shu1, SHI Wen-jun1, WANG Xiao-xi1, LI Jing2, GU Xue1, YAN Chao1,*
(1. School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China; 2. Unimicro (Shanghai) Technologies Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

An effective, convenient and fast method for the analysis of fat-soluble vitamins in vitamin tablets was developed using pressurized capillary electrochromatography (pCEC) with ultra violet (UV) detection. The separations was performed on a reversed-phase C18capillary column with a certain detection wavelength-time program. The mobile phase was 95% (V/V) methanol containing 0.05% TFA (pH 3.3) at a flow rate of 0.2 mL/min with a separation voltage of 15 kV. Four fatsoluble vitamins (vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K3) were baseline separated within 5 min in an isocratic pCEC mode. The detection limits for vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K3(RSN= 3) were 1.5, 3.0, 15 and 1.5 μg/mL with good linearity, respectively. The interference on the analysis of vitamin tablets was effectively eliminated. The recoveries of spiked fat-soluble vitamin samples were 90.0%-110.0% with RSD ranging from 0.53% to 5.46%. This method is simple, rapid, repeatable and accurate.

pressurized capillary electrochromatography (pCEC); ultra-violet (UV) detection; fat-soluble vitamin; vitamin tablets

O657

A

1002-6630（2014）20-0105-05

10.7506/spkx1002-6630-201420021

2013-11-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21175092）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21105064）；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2011YQ150072；2011YQ15007204；2011YQ15007207；2011YQ15007210）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12ZR1413600）

鄭署（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧訅好?xì)管電色譜體系的優(yōu)化及其在食品添加劑中的應(yīng)用。

E-mail：zs559618@163.com

*通信作者：閆超（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯V分析。E-mail：chaoyan@unimicrotech.com