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    重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶溫控型工程菌的構(gòu)建及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2014-01-18 08:33:13張洪斌凌國慶胡雪芹
    食品科學(xué) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:工程菌產(chǎn)酶環(huán)糊精

    凡 寧,張洪斌*,凌 凱,凌國慶,胡雪芹

    (合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶溫控型工程菌的構(gòu)建及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    凡 寧,張洪斌*,凌 凱,凌國慶,胡雪芹

    (合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法從蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)中擴(kuò)增了β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β-cyclodextrin glucanotransferase,β-CGTase)基因,將該基因克隆到pBV220質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和酶切驗(yàn)證后,得到能表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌E.coli DH5α/pBVcgt。通過對(duì)工程菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,得到最佳產(chǎn)酶條件為:OD600nm值達(dá)到1.0、初始培養(yǎng)溫度30℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH8.0、溫度梯度誘導(dǎo)39℃培養(yǎng)0.5h,40℃培養(yǎng)0.5h,41℃培養(yǎng)1h,42℃培養(yǎng)2h。酶活力由優(yōu)化前的445U/mL提高到956U/mL,酶活力提高了1.15倍。溫度梯度誘導(dǎo)比直接誘導(dǎo)酶活力提高20%。該酶的克隆表達(dá)以及發(fā)酵條件的研究表明,該酶能在大腸桿菌原核表達(dá)體系中高效表達(dá)。

    蠟狀芽孢桿菌;β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶;工程菌;表達(dá);培養(yǎng)條件

    環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase,EC2.4.1.19)是一種重要的工業(yè)用酶,不僅能催化淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等α-1,4-葡萄糖聚合物合成環(huán)糊精(cyclodextrin,CD),也可用于一些糖類和配糖物的化學(xué)改性[1]。該酶屬于α-淀粉酶家族,是一種多功能型酶,除了具有環(huán)化作用,也具有耦合和歧化作用,同時(shí)還有弱的水解作用[2]。至今已從許多微生物中分離得到CGTase,如:Bacillus sp.[3],Paenibacillus sp.[4]和Thermoanaerobacter sp.[5],其中以Bacillus sp.為主。CD是由多個(gè)D-吡喃葡萄糖單元通過α-(1,4)糖苷鍵連接成的一類環(huán)狀低聚糖。目前常用的環(huán)糊精主要有3種,分別是由6、7、8個(gè)葡萄糖單元組成的α-、β-和γ-CD[6]。CDs是一種具有內(nèi)疏水外親水的筒形結(jié)構(gòu),能與許多疏水客體化合物或功能基團(tuán)形成包含物,從而改變其物理或化學(xué)性質(zhì),這種特殊的性質(zhì)使環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7-11]。目前環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成,但由于野生菌株的產(chǎn)酶能力普遍較低以及低的轉(zhuǎn)化率、加之生成的環(huán)糊精分離提純困難等原因,導(dǎo)致環(huán)糊精生產(chǎn)成本太高,限制了它們的擴(kuò)大生產(chǎn)和應(yīng)用。因此為了獲取適合工業(yè)化生產(chǎn)的CGTase產(chǎn)酶菌株,對(duì)CGTase進(jìn)行分子生物學(xué)研究,構(gòu)建工程菌株,獲得穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高、易于分離純化的重組CGTase越來越受到重視。Petrova[12]和Lee[13]等將CGTase基因克隆并轉(zhuǎn)入到E. coli體內(nèi)獲得了表達(dá),Takano等[14]將β-CGTase基因克隆并整合到B.subtilis體內(nèi),同樣獲得了表達(dá)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的重組CGTase工程菌均為異丙基硫代-β-D-半乳糖(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)型,IPTG價(jià)格昂貴且去除方法復(fù)雜,一些國家已經(jīng)明文規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白的發(fā)酵工藝中不能使用IPTG;本實(shí)驗(yàn)所使用的質(zhì)粒pBV220是溫控型的,操作簡單且成本低,所以倍受人們的青睞。

    本實(shí)驗(yàn)室通過在篩選平板中加入酚酞的方法從土壤中分離出一株能產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β-CGTase)的芽孢桿菌Bacillus cereus strain LGQ01,將其基因克隆到質(zhì)粒pBV220中,構(gòu)建了溫控型工程菌株E.coli DH5α/pBV220-CGTase(pBVcgt),并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究,這為今后環(huán)狀糊精的酶法制備及擴(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用打下了技術(shù)基礎(chǔ),使該酶能更好的應(yīng)用在淀粉加工工業(yè)中。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    Bacillus cereus strain LGQ01由本實(shí)驗(yàn)室篩選;菌株E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存;克隆質(zhì)粒PUC57和表達(dá)質(zhì)粒pBV220均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.1.2 酶與試劑

    限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司;TaqDNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker、考馬斯亮藍(lán)R-250、氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、X-gal、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。普通LB培養(yǎng)基[15],需要時(shí)加入終質(zhì)量濃度為100?g/mL的Amp。

    1.2 方法

    1.2.1 β-CGTase基因的克隆

    基因克隆參考文獻(xiàn)[16],以Bacillus cereus strain LGQ01的基因組DNA為模板,依據(jù)GenBank公布的Bacillus sp.菌株CGTase基因序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物為:上游引物:5’-CGCGGATCCATGATTCGCCA AGCTTTA-3’;下游引物:5’-AAAACTGCAGTTAC CAATTTGATATG-3’。上下游引物分別含有BamH I和Pst I限制性酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃,3 min;94 ℃,30 s;55 ℃,1 min;72 ℃,2 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min。將擴(kuò)增得到的β-CGTase基因與PUC57載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài),采用藍(lán)白斑篩選后挑白色菌落在含有Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切電泳分析和序列鑒定。序列鑒定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

    1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的篩選

    對(duì)測序鑒定后的質(zhì)粒PUC57-cgt和載體pBV220分別用BamH I和Pst I雙酶切,凝膠電泳回收后,T4 DNA連接酶16℃連接過夜。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在轉(zhuǎn)化平板上經(jīng)Amp初步篩選,然后小量培養(yǎng)用酶切電泳分析方法篩選陽性克隆。

    1.2.3 β-CGTase的表達(dá)和檢測

    把含有重組質(zhì)粒的工程菌接種到含Amp的LB中,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜,然后按1%接種量轉(zhuǎn)接到含50 mL新鮮LB的三角瓶中,按上述培養(yǎng)條件至OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí),42 ℃誘導(dǎo)6 h后,4 ℃、8 000×g離心20 min收集菌體進(jìn)行破碎,取上清檢測其活力,并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳方法[17]分析表達(dá)產(chǎn)物。

    1.2.4 酶水解活力的測定[18]

    取10 μL適當(dāng)稀釋的酶液,加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)0.2 mL,再加入0.2 g/100 mL可溶性淀粉0.2 mL,振蕩,于40 ℃水浴10 min,立即加0.5 mol/L醋酸0.5 mL終止反應(yīng),然后加入0.005%碘液顯色3 min,同時(shí)以蒸餾水為空白,不加酶液為對(duì)照,在700 nm波長處測定吸光度(A),一個(gè)酶活單位定義為使吸光度下降10%的酶量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重組β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶工程菌的構(gòu)建及表達(dá)

    將PCR產(chǎn)物與PUC57載體連接后,挑白色菌落小量培養(yǎng),提取其質(zhì)粒用BamH I和Pst I雙酶切,1.0%瓊脂糖凝膠電泳,可在約2 100 bp處看到目的基因的條帶(圖1)。以測序確證的陽性克隆的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增β-CGTase基因,將經(jīng)BamH I和Pst I雙酶切后的目的基因與pBV220載體連接后,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pBVcgt(圖2)。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)中,經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和雙酶切驗(yàn)證后,得到表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌。重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證如圖3所示。取上清測酶活,上清液中有明顯的酶活力,SDS-PAGE電泳圖如圖4所示。說明該酶在大腸桿菌中成功獲得表達(dá)。

    圖1 重組克隆載體PUC57-ccggtt酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid PUC57-cgt by agarose gel electrophoresis

    圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220--cgtFig.2 Expression plasmid pBV220-cgt

    圖3 重組表達(dá)載體pBV220-cgt酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid BV220-cgt by agarose gel electrophoresis

    圖4 4 β-CGTase表達(dá)的SDS-PAGE分析AGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant β-CGTase from E. coli DH5α (pBVcgt)

    2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2.2.1 誘導(dǎo)開始時(shí)菌濃(OD600nm)對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    在50mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH7.0)中按1%接種量接入種子液后,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)到菌濃OD600nm值達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6時(shí),42 ℃誘導(dǎo)6 h后取出培養(yǎng)液處理后測酶活,所得的工程菌菌濃與酶活力的關(guān)系如圖5所示。菌濃較低時(shí),酶活力隨菌濃增加而增大,達(dá)到1.0時(shí)酶活力最高,之后酶活力降低。菌濃在1.0時(shí),此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長期,易于誘導(dǎo)而合成外源蛋白,因此表現(xiàn)出較高的活力,之后隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,菌體比生長速率下降,而導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降。

    圖5 誘導(dǎo)開始時(shí)菌體濃度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.5 Effect of OD600nm(initial cell density) on the activity of β-CGTase

    2.2.2 初始培養(yǎng)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH 7.0)中按1%接種量接入種子液后,菌體分別在28、30、32、35、37 ℃,250 r/min培養(yǎng),當(dāng)菌濃OD600nm值分別達(dá)到1.0 時(shí),將溫度均調(diào)至42 ℃誘導(dǎo)6 h后取樣處理測定酶活力,結(jié)果如圖6所示。初始培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)酶活力最高,之后隨著培養(yǎng)溫度升高酶活力迅速下降??赡苁且?yàn)榇藭r(shí)的培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)溫度之間溫差較大從而有利于重組酶的誘導(dǎo)合成所致;隨著初始培養(yǎng)溫度的升高,溫差逐漸減小,產(chǎn)酶量也隨之下降,較低的培養(yǎng)溫度不利于菌體的生長,所以酶的表達(dá)量不高。

    圖6 初始培養(yǎng)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.6 Effect of initial culture temperature on the activity of β-CGTase

    2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    在50mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)中按1%接種量接入種子液后,30 ℃、250 r/min培養(yǎng),當(dāng)菌濃OD600nm值均達(dá)到1.0時(shí),將溫度調(diào)節(jié)到42 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后取樣處理測定酶活力,結(jié)果如圖7所示。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值較低時(shí)酶活力隨pH值的升高而增大,在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大,之后降低。由此可知,偏堿性環(huán)境較適合工程菌產(chǎn)酶,強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件對(duì)工程菌產(chǎn)酶有抑制作用。

    圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pHH值對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.7 Effect of initial medium pH on the activity of β-CGTase

    2.2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    圖8 誘導(dǎo)溫度對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.8 Effect of induction temperature on the activity of β-CGTase

    在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH 8.0)中按1%接種量接入種子液后,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí),分別在39、40、41、42、43℃條件下誘導(dǎo)6h后取樣處理測定酶活力,結(jié)果如圖8所示。42℃誘導(dǎo)最適合工程菌產(chǎn)酶,較高溫度則不利于產(chǎn)酶。這與載體pBV220自身的結(jié)構(gòu)有關(guān),該載體含有編碼對(duì)PL啟動(dòng)子有抑制作用而又對(duì)溫度敏感的cI蛋白基因cIts857,該基因在30 ℃時(shí)具有抑制啟動(dòng)子的活性,而在42℃時(shí)失活從而失去抑制啟動(dòng)子的活性,此時(shí)的啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的起始RNA轉(zhuǎn)錄的功能,因此,此溫度下誘導(dǎo)表現(xiàn)出較高的酶活力。

    2.2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    圖9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)β-CGTase酶活力的影響Fig.9 Effect of induction time on the activity of β-CGTase

    在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH 8.0)中按1%接種量接入種子液后,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí),42 ℃分別誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7h后取樣處理測定酶活力,結(jié)果如圖9所示。誘導(dǎo)4 h時(shí)產(chǎn)酶量最高,延長誘導(dǎo)時(shí)間則不利于產(chǎn)酶。誘導(dǎo)時(shí)間與溫控啟動(dòng)子有關(guān),許多研究表明,該表達(dá)載體在42 ℃的最佳誘導(dǎo)時(shí)間是4 h。如徐礪瑜等[19]研究利用溫控表達(dá)載體pBV220,在42 ℃對(duì)外源基因dhaB及yqhD進(jìn)行熱擊誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,獲得了較高活力的酶。誘導(dǎo)時(shí)間較短,啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄功能較低;延長誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌生長不利,因此都表現(xiàn)出較低的酶活力。

    2.2.6 溫度梯度誘導(dǎo)對(duì)β-CGTase酶活力的影響

    表1 溫度梯度誘導(dǎo)對(duì)β-CGTase酶活力的影響Table1 Effect of induction at gradient temperatures on the activity of β-CGGTTaassee

    在50 mL含Amp的LB培養(yǎng)基(pH 8.0)中按1%接種量接入種子液后,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)到OD600nm值達(dá)到1.0 時(shí),溫度梯度設(shè)為:39、40、41、42 ℃。誘導(dǎo)4 h后測酶活力。由表1可知,溫度梯度誘導(dǎo)有利于工程菌產(chǎn)酶。最佳誘導(dǎo)溫度的分配為:39 ℃誘導(dǎo)0.5 h,40 ℃誘導(dǎo)0.5 h,41 ℃誘導(dǎo)1 h,42 ℃誘導(dǎo)2 h。此時(shí)酶活力高于42 ℃直接誘導(dǎo)4 h的活力,是由于直接誘導(dǎo)時(shí)溫度的變化一是使得菌體的生長壓力突然增加不利于菌體生長;二是蛋白基因cIts857突然失活,導(dǎo)致啟動(dòng)子的抑制作用突然消失,在短時(shí)間內(nèi)合成大量的重組蛋白,由于合成速度太快導(dǎo)致重組蛋白未能正確折疊,形成較多的包涵體,所以表現(xiàn)出較低的酶活力。

    3 討 論

    本研究通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將從土壤中篩選的Bacillus cereus strain LGQ01的β-CGTase基因克隆到溫控型表達(dá)載體pBV220中,轉(zhuǎn)入E.coli DH5α,獲得表達(dá)β-CGTase的重組大腸桿菌。SDS-PAGE結(jié)果顯示,除了目的蛋白外,還含有一些其他雜蛋白,但目的蛋白表達(dá)量最多,分子質(zhì)量為70kD,與Zhou Yi等[20]報(bào)道的一致,與Petrova[12]和Lee[13]等報(bào)道的相近。通過對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究表明,該酶能在溫控原核表達(dá)體系中獲得高效表達(dá)。這對(duì)該酶的大規(guī)模發(fā)酵具有重要意義。

    本研究所采用的表達(dá)載體pBV220長度為3 666 bp,選擇性標(biāo)記為Amp抗性,不僅具有串聯(lián)的PL和PR啟動(dòng)子,可以增強(qiáng)其啟動(dòng)作用;而且含有編碼對(duì)PL啟動(dòng)子有抑制作用而又對(duì)溫度敏感的cI蛋白基因cIts857調(diào)控基因cI,因此可用溫度對(duì)插入其中的外源基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。與T7誘導(dǎo)啟動(dòng)子相比,溫控誘導(dǎo)不需要額外添加IPTG誘導(dǎo)劑,不僅操作簡單,而且無毒無害,價(jià)格低廉,因此在本研究的基因工程產(chǎn)品工業(yè)化時(shí),溫控啟動(dòng)子比誘導(dǎo)啟動(dòng)子有其明顯的優(yōu)越性和現(xiàn)實(shí)意義。

    通過對(duì)工程菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,酶活力由優(yōu)化前的445 U/mL提高到956 U/mL,酶活力提高了1.15 倍,得到最佳產(chǎn)酶條件為:OD600nm值達(dá)到1.0,工程菌最初培養(yǎng)溫度30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.0、梯度誘導(dǎo)39 ℃培養(yǎng)0.5 h,40 ℃培養(yǎng)0.5 h,41 ℃培養(yǎng)1 h,42 ℃培養(yǎng)2 h。溫度梯度誘導(dǎo)比直接誘導(dǎo)效率高,酶活力提高了20%,原因是梯度誘導(dǎo)不利于包涵體的形成。本研究構(gòu)建的溫控型工程菌在高溫誘導(dǎo)下表現(xiàn)出較高的水解酶活力,而目前報(bào)道的工程菌表達(dá)量都不高[21],并且大都是IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶,生產(chǎn)成本高且IPTG不易去除;何飛燕等[22]建立以酚酞作指示劑,在瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上篩選環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)突變株的平板快速篩選法,從土壤分離物中篩選到l株葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌gxmfl,37 ℃、250 r/min搖床發(fā)酵3 d,產(chǎn)酶活力為1 524 U/mL。曹新志等[23]對(duì)l株產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的嗜堿芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后,發(fā)酵液的酶活可達(dá)5 400 U/mL左右。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的溫控型工程菌產(chǎn)酶活力雖然低于這些野生菌產(chǎn)酶活力,但由于該工程菌具有產(chǎn)酶周期明顯較短的優(yōu)勢,因此該酶是有望在β-環(huán)糊精的酶法制備工業(yè)化生產(chǎn)中得到應(yīng)用的。但還需進(jìn)一步對(duì)異源高效表達(dá)的條件進(jìn)行研究,提高重組酶活力,使該工程菌能夠產(chǎn)業(yè)化,真正為國民經(jīng)濟(jì)服務(wù)。

    [1] 張洪斌, 凌國慶, 胡雪芹, 等. N+注入誘變選育β-環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(15): 239-245.

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    Construction of Temperature-Regulated Recombinant Escherichia coli for β-CGTase Expression and Optimization of Culture Conditions

    FAN Ning, ZHANG Hong-bin*, LING Kai, LING Guo-qing, HU Xue-qin
    (School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

    The β-CGTase gene from Bacillus cereus was cloned in pBV220 plasmid after PCR amplification. The recombinant plasmid was transformed into E. coli DH5α. After ampicillin-resistance screening and restriction enzyme digestion analysis, we acquired recombinant E. coli DH5α/pBVcgt. The optimum fermentation conditions in shaking flask were acquired as follows: OD600nm= 1.0, initial culture temperature 30 ℃, initial medium pH 8.0, and gradient-temperature induction at 39 ℃ for 0.5 h followed by 40 ℃ for 0.5 h, 41 ℃ for 1 h and 42 ℃ for 2 h. The activity of β-CGTase under these fermentation conditions was increased from 445 to 956 U/mL, representing a 2.15-fold increase compared to that obtained before optimization. Cloning and expression of the β-CGTase gene showed that this enzyme could be expressed highly in E. coli expression system. Therefore, this study proves the possibility of protein engineering of β-CGTase for largescale production of β-CD.

    Bacillus cereus; β-cyclodextrin glucanotransferase; engineered bacteria; expression; culture conditions

    Q814

    A

    1002-6630(2014)11-0155-05

    10.7506/spkx1002-6630-201411031

    2014-02-13

    安徽省自主創(chuàng)新專項(xiàng)(2013AKKG0391)

    凡寧(1987—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樯锘?。E-mail:fanning56789@163.com

    *通信作者:張洪斌(1970—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樯锘づc酶工程。E-mail:hbzhang@hfut.edu.cn

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