His-N2蛋白體外排除抑制大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液蛋白的研究

都立輝，張 虹，施榮華，和肖營，劉 琴

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210023）

His-N2蛋白體外排除抑制大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液蛋白的研究

都立輝，張 虹，施榮華，和肖營，劉 琴

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210023）

以植物乳桿菌KLDS1.0320候選表面黏附蛋白NP_785232 N端前兩個結構域組成的融合表達蛋白為研究對象，采用體外模擬腸道環(huán)境的方法研究其對大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液的排除抑制作用。對豬腸黏液進行固定，加入His-N2融合表達蛋白37℃孵育1h，再加入大腸桿菌DH5α菌懸液37℃孵育1h，洗去未黏附的菌體，之后用1%Triton X-100進行裂解，將裂解液涂布LB瓊脂平板以進行菌落計數(shù)。結果表明：pH值為6.6時，相對于緩沖液陰性對照組，His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液的抑制率為（50.37±3.66）%，相對于BSA蛋白對照組的抑制率為（38.33±4.55）%；pH值為7.5時，相對于緩沖液陰性對照組，His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液的抑制率為（42.18±3.44）%，相對于BSA蛋白對照組的抑制率為（34.48±3.90）%。在體外模擬條件下，由植物乳桿菌KLDS1.0320的候選表面黏附蛋白NP_785232 N端前兩個結構域組成的His-N2蛋白能排除抑制大腸桿菌DH5α對豬腸黏液蛋白的黏附。

植物乳桿菌；His-N2蛋白；大腸桿菌；豬腸黏液；排除抑制

乳酸桿菌（Lactobacillus）是一類菌體形狀呈桿狀或棒球桿狀的革蘭氏陽性細菌的總稱。其DNA的G＋C含量低于55%，兼性厭氧或嚴格厭氧，無芽孢和莢膜，對營養(yǎng)要求高，發(fā)酵碳水化合物時產生大量乳酸，嗜酸性，最適生長pH值范圍為5.5～6.2，在自然界中分布廣泛，是人和動物消化道等部位的重要生理性菌群之一。

乳酸桿菌具有公認的生物安全性（generally regarded as safe，GRAS）和益生作用，其益生作用主要包括：調節(jié)和維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[1]；協(xié)同和促進食物的消化吸收[2-4]；強化腸黏膜系統(tǒng)的屏障作用，抑制病原菌的黏附和定殖[5-7]；直接或間接地增強機體的免疫能力[8-11]。正是由于乳酸桿菌的這些安全、綠色的益生功能，使之成為國內外微生態(tài)制劑領域的研究熱點之一。目前，不少研究已經(jīng)證實乳酸桿菌具有抑制病原菌黏附細胞和宿主腸道的作用[12-13]，但其抑制作用的具體機制，即乳酸桿菌與病原菌和腸道分子之間的相互作用方式尚不明確，相關報道也較少，這極大地制約了人類對乳酸桿菌益生作用的認知水平。

乳酸桿菌能夠在宿主腸道中黏附并定殖是其發(fā)揮益生功能的前提。細菌的黏附是菌體表面多種結構參與的復雜過程，這些結構包括多糖、脂磷壁酸、細胞壁毛緣和細菌表面蛋白等。文獻報道的與黏附相關的乳酸桿菌表面蛋白有S-層蛋白、引物酶sortase依賴蛋白和黏膜結合蛋白[14]等。這些黏附蛋白的存在佐證了乳酸桿菌在腸道中的黏附定殖能力，同時不同黏附蛋白的存在也暗示它們可能通過不同的機制促進相應菌體的黏附。因此，研究黏附蛋白與腸道分子的相互作用，必將從分子水平上揭示乳酸菌在腸道定殖及其益生作用的內在機理。

本實驗以植物乳桿菌KLDS1.0320候選表面黏附蛋白NP_785232 N端前兩個結構域組成的融合蛋白（His-N2蛋白）為研究對象，采用外源重組表達的方法對其進行大量誘導表達，依次通過親和色譜和排阻色譜等分離技術對His-N2蛋白進行分離純化。在此基礎上，通過體外固定豬腸黏液以模擬腸道環(huán)境，研究His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α菌株黏附豬腸黏液的排除抑制作用。研究結果為進一步確證His-N2蛋白在植物乳桿菌黏附宿主腸道過程中的具體作用及其抑制病原菌黏附的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌DH5α菌株由本實驗室保存。

1.2 材料與試劑

豬腸黏液由如皋市太陽腸衣食品有限公司惠贈；BCA蛋白定量試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；HisTrap HP柱、Sephadex G-25填料、HiTrapTMDesalting 5mL柱 美國GE公司；滅菌96孔細胞培養(yǎng)板 南京丁貝生物科技有限公司；PBS緩沖液、牛血清白蛋白（BSA蛋白）等其他常規(guī)藥品及試劑均為國產分析純。

1.3 儀器與設備

THZ-D型恒溫振蕩器 江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司；無菌工作臺 上海三發(fā)科技有限公司；微量臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientif c公司；高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；J-26XP落地式高速冷凍離心機 德國Beckman Coulter公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；U-3900紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；梯度PCR自動系列化分析儀 東盛國際貿易有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-6800全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新藝超聲設備有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)美國GE公司；SpectraMax M2e 酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.4 方法

1.4.1 His-N2蛋白的制備

首先使用1mmol/L 的IPTG對融合有NP_785232蛋白N端兩個特定結構域基因pET30a/N2重組質粒的E.coli Rosetta（DE3）表達菌株進行誘導表達，然后使用HisTrap HP親和色譜柱進行初步分離后再使用Sephadex G-25填料對兩種分子質量不同的蛋白進行分離，最后使用HiTrapTMDesalting 5mL柱將分離獲得的較高純度的His-N2蛋白緩沖液置換為0.01mol/L 的PBS緩沖液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定所制備蛋白溶液的質量濃度，用直徑為0.22μm的濾膜過濾除菌后進行1mL分裝，置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 豬腸黏液的制備與固定

選取健康并即將宰殺的中年豬（9月齡），宰殺前禁食2 h，宰殺后迅速剖開腹腔，將豬的小腸取出，其中包括十二指腸、空腸和回腸，剪開腸壁并用預冷的無菌生理鹽水沖洗2 次，然后用干凈的載玻片輕輕刮取腸黏膜層上的黏液，轉移至無菌的0.01 mol/L PBS緩沖液中混勻。4 ℃、13 000 r/min離心10 min去除細胞和組織碎片，取上清液，用等體積的石油醚去脂3 次，然后依次用直徑為0.45、0.22 μm的濾膜過濾除菌。使用BCA蛋白定量試劑盒測定所制備黏液中的蛋白濃度，適當分裝后于－80 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

豬腸黏液的固定[16]：在96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL已制備好的豬腸黏液，4 ℃固定16 h。

豬腸黏液固定效果的檢測：將4 ℃固定16 h的豬腸黏液在37 ℃預溫30 min后，吸棄未被固定的豬腸黏液，輕輕加入100 μL PBS緩沖液洗滌1 次，再加入100 μL 1%的Triton X-100室溫裂解10 min，同時以未固定豬腸黏液的細胞培養(yǎng)板空孔作為對照。選取適當稀釋梯度使用BCA蛋白定量試劑盒測定裂解液的蛋白質量濃度，每組做3 次重復實驗。

1.4.3 蛋白質質量濃度的測定

蛋白質質量濃度標準曲線的繪制參考BCA蛋白定量試劑盒說明書。根據(jù)測得的樣品吸光度，在標準曲線上查得并計算出制備的His-N2蛋白溶液和豬腸黏液中蛋白質量濃度。

1.4.4 菌株培養(yǎng)

吸取50μL活化的大腸桿菌DH5α菌懸液（1%接種量）于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌泥2 次后再用PBS緩沖液重新懸浮菌體，將菌體濃度調整到1×108CFU/mL左右用于黏附實驗。

1.4.5 不同孵育時間對大腸桿菌DH5α黏附量的影響

將已固定豬腸黏液的96 孔細胞培養(yǎng)板和大腸桿菌DH5α菌懸液置于37 ℃預溫30 min；吸棄未被固定的豬腸黏液，輕輕加入100 μL PBS緩沖液洗滌1 次，然后每孔加入100 μL已調整好濃度的菌懸液，37 ℃分別孵育15、30、45、60、90、120、180 min，每個孵育時間做3次重復實驗；孵育到設定的時間后，吸棄殘留菌液，然后用PBS緩沖液輕輕洗滌6 次（100 μL/次）以去除未黏附的菌體；向每孔中加入200 μL 1%的Triton X-100室溫裂解10 min；用PBS緩沖液對細胞裂解液進行10 倍連續(xù)梯度稀釋；選取適當梯度的稀釋液進行涂布LB瓊脂平板以對大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)和計數(shù)(人工計數(shù)，選取菌落數(shù)在30～300左右的平板記錄數(shù)據(jù))，每個梯度稀釋液做3 次重復實驗，每次取100 μL稀釋液進行涂布，37 ℃培養(yǎng)過夜。大腸桿菌DH5α的黏附量以（CFU/mL）表示。

1.4.6 His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α黏附的排除抑制作用實驗

His-N2蛋白、大腸桿菌DH5α和豬腸黏液三者之間的相互作用方式有3 種：競爭抑制、排除抑制和替換。本實驗主要研究二者之間的排除抑制作用，操作步驟如下：將已固定豬腸黏液的96 孔細胞培養(yǎng)板、0.01 mol/L PBS緩沖液、BSA蛋白溶液、His-N2蛋白溶液以及大腸桿菌DH5α菌懸液置于3 7 ℃下預溫30 min；吸棄未被固定的豬腸黏液，輕輕加入100 μL PBS緩沖液洗滌1 次，然后按照表1進行加樣，每組做3次重復實驗，加樣完畢，37 ℃孵育1 h；吸棄多余溶液，向每孔中加入100 μL菌懸液，37 ℃孵育1 h；之后操作步驟同1.4.5節(jié)。

表1 排除抑制實驗的分組及加樣Table1 Sample groups used in exclusive inhibition tests

分別配制pH值為6.6和7.5的0.01mol/L的PBS緩沖液，滅菌后用于制備His-N2蛋白溶液、豬腸黏液、菌懸液以及與His-N2蛋白溶液濃度相同的BSA蛋白溶液，按照上述方法進行排除抑制實驗。大腸桿菌DH5α的黏附量以±s表示。

式中：A0為加入PBS緩沖液或BSA蛋白溶液的對照組黏附的大腸桿菌DH5α數(shù)量/（CFU/mL）；A1為加入His-N2蛋白溶液的實驗組黏附大腸桿菌DH5α的數(shù)量/（CFU/mL）。

2 結果與分析

2.1 His-N2重組蛋白的制備

圖1 經(jīng)HisTrap HP親和色譜柱（A）和Sephadex G-25填料（B）純化后得到的蛋白溶液SDS-PAGE電泳結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified protein by HisTrap affinity chromatography (A) and Sephadex G-25 (B)

由圖1A可知，分離獲得的蛋白溶液中主要有兩種分子質量不同的蛋白，第1條帶為分子質量在135 kD左右的蛋白，第2條帶為質譜鑒定正確的His-N2蛋白。再使用Sephadex G-25填料對這兩種分子質量不同的蛋白進行分離后，SDS-PAGE電泳分析結果如圖1B所示。經(jīng)蛋白質Marker比對，泳道2中主要含有分子質量為63～75 kD的His-N2蛋白，這說明經(jīng)Sephadex G-25填料裝填的分離柱再分離后可獲得較高純度的His-N2蛋白。

2.2 His-N2蛋白溶液和豬腸黏液蛋白含量的測定

根據(jù)蛋白含量標準曲線獲得回歸方程為：y= 21.66x－0.529（R2=0.997）。根據(jù)方程及所測得的樣品的A562nm可得制備的His-N2蛋白溶液蛋白含量為3.9 mg/mL，制備的豬腸黏液蛋白含量為1.4 mg/mL，將豬腸黏液4 ℃固定16 h再37 ℃預溫30 min后，96 孔細胞培養(yǎng)板中每孔含有5.29 μg蛋白，可說明豬腸黏液蛋白已被固定。

2.3 不同孵育時間對大腸桿菌DH5α黏附量的影響

圖2 不同孵育時間對大腸桿菌DH5α黏附量的影響Fig.2 Effect of incubation time on the adhesion of E. coli DH5α

如圖2所示，大腸桿菌DH5α對豬腸黏液的黏附量隨著孵育時間的延長而增加，黏附量趨于飽和的孵育時間為90min。大腸桿菌DH5α對豬腸黏液的最大黏附量約為5.5×106CFU/mL。

2.4 His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α黏附的排除抑制作用

表2 His-N2蛋白對大腸桿菌DH5黏附的抑制率Table2 Inhibition rates of E. coollii DDHH55α adhesion to porcine intestinal mucus by His-N2 protein

由表2可知，無論固定豬腸黏液與否，在兩個pH值條件下，相對于陰性對照組和陽性對照組，His-N2蛋白均對大腸桿菌DH5α的黏附有明顯抑制作用。

3 討 論

隨著經(jīng)濟和社會的迅速發(fā)展，人們在不斷提高生活水平的同時也更加注重自身的健康狀況。醫(yī)學也從治療為主發(fā)展到預防為主，進而到現(xiàn)在的保健醫(yī)學。人們開始漸漸形成提前預防、無病保健的意識。此外，近年來由于抗生素等藥物在預防和治療人及動物傳染病上的不規(guī)范使用而引起的胃腸道功能紊亂以及致病菌的耐藥性增強和動物產品藥物殘留等問題引發(fā)了人們的廣泛關注，因此，尋求并開發(fā)對動物及人類安全有效，對環(huán)境綠色無污染的抗生素替代品已迫在眉睫。乳酸桿菌作為人和動物消化道中的正常微生物菌群之一，除了能直接食用、對環(huán)境無污染外，還具有維持和改善腸道微生態(tài)體系的平衡、抑制致病菌的黏附和定殖以及提高機體免疫力等益生功能，是一種理想的綠色生物添加劑。

目前，乳酸桿菌的益生作用已被廣泛研究和證實，但人們對其益生機制仍不太清楚。不少研究報道，乳酸桿菌能抑制致病菌對細胞和宿主腸道的黏附，如唾液乳酸桿菌（Lactobacillus salvarius）CTC2197可競爭抑制腸炎沙門氏菌C-114在來亨雞腸道內的定植和繁殖[17]，L. rhamnosus GG和L. casei Shirota能競爭和排除抑制腸道致病菌對人腸黏膜糖蛋白和Caco-2細胞的黏附，但是置換的效率卻比較低，且抑制程度因菌株而異[13]。這些研究只是初步揭示了乳酸桿菌的益生機制，其抑制致病菌黏附的具體機制，即發(fā)揮抑制作用的乳酸桿菌相關結構及作用方式仍有待進一步研究。

陳雪燕[12]研究了卷曲乳酸桿菌ZJ001的耐強酸和膽鹽的能力，對體外培養(yǎng)細胞的黏附能力、對病原菌的抑制能力以及其菌體表面S-層蛋白的結構和功能，結果表明S-層蛋白參與了L. crispatus ZJ001黏附HeLa細胞的過程，并在拮抗鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7的黏附過程中發(fā)揮了重要作用。盡管如此，目前國內外還鮮有報道體外模擬腸道環(huán)境，并通過外源表達乳酸桿菌表面蛋白以研究其在抑制病原菌黏附過程中作用的報道。據(jù)文獻報道[18-20]，十二指腸pH值一般為6.63±0.53，空腸pH值一般為7.41±0.36，回腸pH值一般為7.49±0.46，結腸pH值一般為6.63±0.67。由于豬腸結構與人體小腸結構非常相似[21]。因此，本實驗在體外模擬腸道環(huán)境時，選擇使用豬腸黏液，環(huán)境溫度設置為37℃、pH值為6.6和7.5。

本實驗以植物乳桿菌KLDS1.0320候選表面黏附蛋白NP_785232 N端前兩個結構域組成的融合蛋白（His-N2蛋白）為研究對象，通過體外模擬腸道環(huán)境，研究了His-N2蛋白對大腸桿菌DH5α黏附豬腸黏液的排除抑制作用，在兩個pH值條件下，無論固定豬腸黏液與否，His-N2蛋白的加入均降低了大腸桿菌DH5α的黏附量；除pH值為6.6條件下固定豬腸黏液加入His-N2蛋白的實驗組外，其余實驗組均是pH值為6.6時，大腸桿菌DH5α的黏附量高于pH值為7.5的相應實驗組。這一結果可能與乳酸桿菌的嗜酸性有關，暗示其表面蛋白可能在酸性和堿性條件下具有不同的空間構象，從而影響了His-N2重組蛋白對大腸桿菌的排除抑制作用，這一推理期待通過以后應用差示掃描量熱儀等進一步的實驗手段進行確認。

綜上，本實驗結果表明His-N2蛋白在體外實驗能有效抑制大腸桿菌DH5α對豬腸黏液的黏附，但鑒于動物腸道結構及腸道菌群的復雜性，His-N2蛋白在體內真實環(huán)境中能否有效抑制大腸桿菌DH5α對豬腸黏液的黏附還有待進一步研究。本實驗結果為深入探索植物乳桿菌KLDS1.0320候選表面黏附蛋白NP_785232的功能及乳酸桿菌的益生機制提供了參考。

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in vitro Exclusive Inhibition of E. coli DH5α Adhesion to Porcine Intestinal Mucus by His-N2 Protein

DU Li-hui, ZHANG Hong, SHI Rong-hua, HE Xiao-ying, LIU Qin
(Jiangsu Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Cereals and Oils, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

His-N2 protein, consisting of two domains at the N terminus of Lactobacillus plantarum KLDS 1.0320 adhesion surface protein NP_785232, was selected as the candidate in this work. This protein was used to explore the exclusive inhibition against E. coli DH5α adhesion to porcine intestinal mucus in vitro. First, porcine mucus was f xed on 96-well cell plates and incubated at 37 ℃ for 1 h after adding His-N2 protein, and then the solution containing E. coli DH5α was added. After co-incubation at 37 ℃ for 1 h, the mucus was washed and disrupted with 1% Triton X-100. Ten-fold dilutions of the cell lysates were prepared and spread on LB agar plates for counting of E.coli DH5α. Results indicated that His-N2 protein could inhibit the adhension of E. coli DH5α to porcine intestinal mucus by (50.37 ± 3.66)% compared with PBS and by (38.33% ± 4.55)% compared with BSA protein at pH 6.6, while the inhibitory rates were (42.18 ± 3.44)% and (34.48 ± 3.90)% at pH 7.5, respectively. Therefore, His-N2 protein is involved in the exclusive inhibition of E. coli DH5α adhersion to porcine intestinal mucus in vitro.

Lactobacillus plantarum; His-N2 protein; E. coli DH5α; porcine mucus; exclusive inhibition

TS201.3

A

1002-6630（2014）11-0095-05

10.7506/spkx1002-6630-201411019

2013-07-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101338）；江蘇省高校自然科學基金面上項目（11KJB550002）；南京財經(jīng)大學研究生創(chuàng)新研究項目（M12067）

都立輝（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：ddabc_2000@163.com