Th1、Th2、Th17細(xì)胞變化及環(huán)境因素與習(xí)慣性流產(chǎn)的關(guān)系研究

李富琴 申玉紅 馮杏琳 張 敏 申 華

河南省開(kāi)封市婦產(chǎn)醫(yī)院，河南開(kāi)封 475000

習(xí)慣性流產(chǎn)（habitual abortion，HA）是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的一種疾病，發(fā)病主要與母體生殖道異常、母體內(nèi)分泌異常、染色體異常、生殖道感染、宮頸功能不全及免疫功能異常等有關(guān)，約50%的HA 病因不明[1]。隨著人們對(duì)疾病的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，尤其是對(duì)輔助性T 細(xì)胞的深入研究，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞亞群分化失衡與HA 密切相關(guān)，且受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[2]。 同時(shí)，環(huán)境因素也不容忽視，如吸煙[3]、飲酒[4]、家族史[5]、體重指數(shù)（BMI）[6]等。 本研究以50 例HA 非孕期患者和50 例正常非孕婦女為研究對(duì)象，采用問(wèn)卷調(diào)查、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTQ-PCR）等技術(shù)，統(tǒng)計(jì)分析問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果，測(cè)定患者外周血Th1，Th2，Th17 的百分比， 細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表達(dá)水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的含量。 旨在探討HA 患者Th1、Th2、Th17 細(xì)胞變化及環(huán)境因素與HA的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011 年6 月～2012 年9 月河南省開(kāi)封市婦產(chǎn)醫(yī)院就診的50 例非孕期HA 患者（HA 組），以及同期50 例健康非孕期婦女 （NNP 組）。 HA 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40 歲；②有兩次或兩次以上自然流產(chǎn)史；③無(wú)糖尿病、高血壓、生殖器畸形等器質(zhì)性疾病。NNP 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡21～40 歲；②與HA 組無(wú)血緣關(guān)系；③無(wú)自然流產(chǎn)史，無(wú)腎炎、肝病、生殖器感染等病史。 所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

莫能霉素、離子霉素和PMA 購(gòu)自Takara 公司，RPMI-1640、小牛血清購(gòu)自Sigma 公司，TapDNA 聚合酶購(gòu)自北京天根公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Guava。

1.3 方法

1.3.1 分離和體外培養(yǎng)PBMC 采集患者抗凝靜脈血5 mL，收集其中的單個(gè)核細(xì)胞層，加入PBS 3 mL，1200 r/min離心洗滌10 min，棄上清。 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸。 在24 孔板上加入PBMC，同時(shí)加入莫能霉素（2 μg/mL）、離子霉素（1 μg/mL）和PMA（25 μg/mL），5 h 后收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表面的CD分子和胞內(nèi)的IFN-γ、IL-4、IL-17 及相應(yīng)的對(duì)照抗體染色，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的含量測(cè)定按照ELISA 試劑盒要求對(duì)患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-17 的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 RTQ-PCR 檢 測(cè)T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達(dá) 將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用RTQ-PCR 技 術(shù) 擴(kuò) 增T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA。 PCR 反應(yīng)體系：10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL，cDNA 2 μL，Primers 各20 μmol/L，Tap 酶0.25 μL，總反應(yīng)體系50 μL。 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃45 s；55℃50 s；72℃1 min；30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。 擴(kuò)增所需引物見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增T-bet、GATA-3 和STAT-3 所需引物

1.3.4 問(wèn)卷調(diào)查 采用一對(duì)一方式，對(duì)HA 組及NNP 組進(jìn)行相同問(wèn)卷調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容主要包括社會(huì)生物學(xué)特征、文化程度、BMI 值、被動(dòng)吸煙狀況和飲咖啡史等。以BMI＜24.0 kg/m2和BMI≥24.0 kg/m2為分段標(biāo)準(zhǔn)，被動(dòng)吸煙以無(wú)、＜1 h/d 和≥1 h/d 為分段標(biāo)準(zhǔn)，飲咖啡以無(wú)、＜100 mg/d 和≥100 mg/d 為界限[1]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較

兩組BMI≥24.0 kg/m2所占比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩組年齡、文化程度、被動(dòng)吸煙、體重指數(shù)（＜24.0 kg/m2）及飲咖啡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見(jiàn)表2。

表2 兩組一般情況比較[n（%）]

2.2 兩組Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞水平比較

與NNP 組相比，HA 組Th1 和Th17 細(xì)胞百分比較高，而Th2 細(xì)胞百分比較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 兩組Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞水平比較（%，±s）

表3 兩組Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞水平比較（%，±s）

注：HA：習(xí)慣性流產(chǎn)；NNP：正常非孕婦女

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2.3 兩組血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表達(dá)水平比較

HA 組IFN-γ 和IL-17 的含量明顯高于NNP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而IL-4 的表達(dá)水平低于NNP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)表4。

表4 兩組血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表達(dá)水平比較（μg/L，±s）

表4 兩組血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表達(dá)水平比較（μg/L，±s）

注：HA：習(xí)慣性流產(chǎn)；NNP：健康非孕期婦女；IFN-γ：γ-干擾素；IL：白細(xì)胞介素

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2.4 兩組T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，以NNP 組3 種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分別為1，與其相比較，HA 組T-bet 和STAT-3 mRNA 的表達(dá)量明顯增高（6.3 倍和3.5 倍），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），GATA-3 mRNA 表達(dá)量顯著降低（P ＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩組T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達(dá)水平

3 討論

輔助性T 細(xì)胞為CD4+T 細(xì)胞，按其所產(chǎn)生的細(xì)胞種類，可分為T(mén)h1 和Th2 細(xì)胞。Th1 細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等；Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、5、6 和IL-10 等。 兩類亞群細(xì)胞對(duì)不同細(xì)胞因子的反應(yīng)性各異：IFN-γ 可誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞分化，但抑制Th2 細(xì)胞增殖；IL-4 誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞分化，但可與IL-13 等一起抑制Th1 細(xì)胞功能和分化。 機(jī)體在正常功能狀態(tài)下，各細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，共同維持機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能。 T-bet 是T-box 基因家族的新型轉(zhuǎn)錄因子，選擇性地表達(dá)于Th1 細(xì)胞，可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，并可抑制IL-4 的分泌。 GATA-3 是Th2 細(xì)胞重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-4。 T-bet 和GATA-3 分別促進(jìn)Th1 和Th2 的發(fā)育，二者存在交互抑制作用[7-8]。Th17 是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠分IL-17 的T細(xì)胞亞群，STAT-3 是其主要的轉(zhuǎn)錄因子[9]。

近年來(lái)的研究報(bào)道顯示，T 細(xì)胞亞群分化失衡與妊娠結(jié)局存在較大關(guān)聯(lián)[10]。 Liu 等[11]研究結(jié)果顯示，正常妊娠婦女外周血Th 細(xì)胞亞群與未妊娠婦女無(wú)差異，而與正常的未妊娠婦女相比，HA 患者外周血Th17比例較高。 這與本研究結(jié)構(gòu)相一致。 本研究結(jié)果還顯示，HA 組Th1 明顯增高以及IFN-γ、IL-17 的水平均高于NNP 組。 Th2 細(xì)胞所占比例及IL-4 的水平均低于NNP 組，表明HA 組患者存在T 細(xì)胞亞群比例以及功能失調(diào)。 另外，從轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平看，HA 組患者T-bet 和STAT-3mRNA 表達(dá)水平較高， 再次證明了HA 組患者Th1 和Th2 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子呈高表達(dá)狀態(tài)。

此外，環(huán)境因素與HA 發(fā)病的關(guān)聯(lián)日益受到學(xué)者們的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此也有相關(guān)報(bào)道。Zhang 等[12]對(duì)中國(guó)南方女性HA 與環(huán)境因素的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析，被動(dòng)吸煙（≥1 h/d）和肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）與HA有關(guān)。 國(guó)外學(xué)者報(bào)道，患者的高胰島素抵抗與HA 相關(guān)[13]，并且由于胰島素抵抗而出現(xiàn)的高血壓、高血脂、高糖與肥胖導(dǎo)致的自然流產(chǎn)有關(guān)[14]。 本研究也發(fā)現(xiàn)，肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）與HA 之間存在關(guān)聯(lián)（P ＜0.05），但未發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙與HA 相關(guān)，這與Zhang 等[12]的研究結(jié)果不相一致，原因可能與本次研究樣本量不足或此次的研究對(duì)象對(duì)煙草的敏感性較低有關(guān)。

HA 的發(fā)生存在多種因素，本研究主要從T 細(xì)胞亞群分化角度和環(huán)境因素兩方面與HA 的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了探討。在今后的研究中，需要從多角度、多方面進(jìn)行深入思考，如HA 的發(fā)生是否存在易感基因，是否與某種病原體感染以及激素水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，并且探討上述因素與環(huán)境因素是否存在交互作用等。

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