低氘水抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的研究

張 力張瀚彬陳 淼 鄔永富 黃浩海 祝葆華 楊慧齡

廣東醫(yī)學(xué)院中美腫瘤研究所，廣東東莞 523808

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤中第3 位最常見(jiàn)的 癌癥，也是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的第4 大原因，并占了近10%的新診斷癌癥病例和8%的癌癥死亡總數(shù)[1]。全球?qū)m頸癌發(fā)病率在1980 年每年約378 000 例，到2010 年已增加到每年約454 000 例[2]。 據(jù)估計(jì)每年我國(guó)新發(fā)宮頸癌病例約100 000 例，占世界子宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的1/5[3]。目前宮頸癌的主要治療手段是手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療。

在自然界中，水是由氕（H）和氘（D）兩種氫的非放射性穩(wěn)定同位素和氧組成的化合物。氘與氧組成的水稱(chēng)為重水，天然水中，氘和氕的比率（D∶H）大約是1∶6600，即自然界水中氘的體積分?jǐn)?shù)為0.0139%～0.0151%[4-8]。 因此，把氘體積分?jǐn)?shù)低于0.015%的水稱(chēng)為低氘水（DDW）。 由于氘對(duì)氕在質(zhì)量上相差約1 倍以及C-D 鍵比C-H 鍵牢固不易斷裂，水中同位素氕和氘含量的變化會(huì)導(dǎo)致水的物理化學(xué)和核性質(zhì)顯著差異。 有研究表明，氘能置換生物體內(nèi)的氕并蓄積下來(lái)，隨著生物體內(nèi)氘濃度的增加，氫鍵間交聯(lián)發(fā)生改變，從而使細(xì)胞質(zhì)剛性顯著增加，有絲分裂受阻滯[9-12]。飲用DDW 可以預(yù)防疾病、延緩衰老、活化機(jī)體免疫細(xì)胞[13-14]。近年國(guó)外核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和水生理學(xué)領(lǐng)域?qū)DW在某些癌癥等疾病的輔助治療的應(yīng)用研究有了重大突破[15-18]。 本文中將比較多種含有不同濃度氘的培養(yǎng)基對(duì)Hela 細(xì)胞株生長(zhǎng)影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DDW（體積分?jǐn)?shù)為0.005%，50×10-6）購(gòu)自上海奧特泉公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco 公司；宮頸癌細(xì)胞株Hela 購(gòu)自美國(guó)ATCC， 并由中美腫瘤所保種；DMEM、RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；PI 染料購(gòu)自北京索萊寶公司；核糖核酸酶A（RNaseA）購(gòu)自Invitrogen；MTT 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；p21 Waf1/Cip1（12D1） Rabbit mAb 購(gòu)自Cell Signaling；βactin （13E5） Rabbit mAb 購(gòu) 自Cell Signaling；Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）購(gòu)自Invitrogen；Na+/K+-ATPase ɑ （H-3） mouse monoclonal lgG2b購(gòu)自Santa Cruz； 免疫組化試劑UltraVision Quanto Detection System HRP Quanto & DAB Quanto 購(gòu)自Thermo Scientific；其他試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

宮頸癌Hela 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS 的1640培養(yǎng)基中，置于含5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 DDW（100×10-6、75×10-6、50×10-6，實(shí)驗(yàn)組）與普通超純水（150×10-6，對(duì)照組）按體積比分別配置成用于Hela 培養(yǎng)的1640 培養(yǎng)基。

1.3 MTT 法檢測(cè)DDW 對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

用不含血清的1640 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)Hela 細(xì)胞24 h 后，用含乙二胺四乙酸（EDTA）0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)， 以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入100 μL 含10%FBS 普通1640 培養(yǎng)基（150×10-6，對(duì)照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）1640 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組），各設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加100 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，選擇490 nm 波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光密度（OD）值。結(jié)果取3 次實(shí)驗(yàn)平均值。計(jì)算DDW 對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。 抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)“1.3”項(xiàng)下方法收集細(xì)胞加入6 孔板中，密度為6×105個(gè)細(xì)胞/孔。用10%FBS 普通1640 培養(yǎng)基（150×10-6，對(duì)照組）及含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）進(jìn)行培養(yǎng)12 h。等細(xì)胞貼壁完全后，用移液槍的10 μL 無(wú)菌槍頭在各個(gè)孔內(nèi)輕劃一條直線(xiàn)，在同一放大倍數(shù)下測(cè)量直線(xiàn)寬度并做好記錄，作為0 h 數(shù)據(jù)。48 h 后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞放置在顯微鏡下觀(guān)察所劃直線(xiàn)寬度變化，并拍照，在同一放大倍數(shù)下測(cè)量直線(xiàn)寬度并做好記錄作為24 h數(shù)據(jù)。將實(shí)驗(yàn)組（100×10-6、75×10-6、50×10-6） 0 h 數(shù)據(jù)與24 h 數(shù)據(jù)差值，分別和對(duì)照組（150×10-6） 0 h 數(shù)據(jù)與24 h 數(shù)據(jù)差值對(duì)比。分析DDW 對(duì)細(xì)胞的侵襲能力影響差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

按實(shí)驗(yàn)“1.3”項(xiàng)下方法收集Hela 細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/mL 的密度接種于直徑為6 cm 的培養(yǎng)皿中，分別加入含10%FBS 的普通1640 培養(yǎng)基 （150×10-6，對(duì)照組） 或不同氘濃度 （100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）培養(yǎng)24 h，用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞。 用70%乙醇固定，4℃過(guò)夜，PBS 清洗1 次，1000 r/min 離心5 min，棄上清；PBS 再清洗1 次，1000 r/min 離心5 min，棄上清；每管加入500 μL 染色液（500 μL PBS+2.5 μL PI+2 μL RNaseA），37℃水浴避光染色30 min，經(jīng)60 目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，立即用流式細(xì)胞儀分析。 計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞周期各期的分布特征。

1.6 Western blot 法檢測(cè)Hela 細(xì)胞p21 蛋白的表達(dá)水平

按實(shí)驗(yàn)“1.3”項(xiàng)下方法收集Hela 細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)細(xì)胞/mL 的密度接種于直徑6 cm 培養(yǎng)皿中，分別加入含10%FBS 的普通1640 培養(yǎng)基（150×10-6，對(duì)照組）或含不同氘濃度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，加入細(xì)胞裂解液RIPA 200 μL 裂解，并加入蛋白酶混合抑制劑20 μL，置冰上30 min 讓其充分裂解，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，4℃、10 000 r/min 離心15 min，吸取上清液分裝置-80℃?zhèn)溆谩?NanoDrop 微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，各孔的蛋白上樣總量一致，均為100 μg。電泳濃縮膠80 V，50 min，分離膠110 V，150 min。經(jīng)過(guò)10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，110 V 500 mA 轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。采用室溫含2.5%脫脂奶粉的PBST（400 mL PBS+40 μL 吐溫20） 封閉60 min，按抗體要求的比例加入兔抗p21 一抗（1∶3000）、兔抗β-actin一抗（1∶3000），4℃過(guò)夜，室溫復(fù)性1 h，PBST 洗膜4 次，10 min/次，按一定比例（1∶10000）加入相應(yīng)的Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lgG（H+L）二抗，室溫避光孵育120 min。PBST 洗去未結(jié)合的二抗3 次，10 min/次，Western blot 紅外熒光顯像儀顯影。

1.7 免疫組織化學(xué)LP 法檢測(cè)p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達(dá)變化

按實(shí)驗(yàn)“1.3”項(xiàng)下方法將Hela 細(xì)胞消化后，分別在6 孔板中每孔平行加入6×105個(gè)細(xì)胞。用普通含10%FBS 1640 普通培養(yǎng)基（150×10-6）及低氘濃度（50×10-6）的1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24 h 后，除去培養(yǎng)基，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%正常羊血清孵育，滴加一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液（Na2HPO48.1 mmol/L，KH2PO41.5 mmol/L，NaCl 137 mmol/L，2.7 mmol/L，pH 7.4） 振蕩清洗后分別滴加二、 三抗，DAB 顯色,蘇木精復(fù)染。 陽(yáng)性信號(hào)呈棕色細(xì)顆粒狀。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響

含氘濃度為100×10-6、75×10-6、50×10-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制率分別為16.01%、26.17%和33.39%，48 h 的抑制率分別為7.98%、25.27%和34.5%，72 h 的抑制率分別為11.42%、21.46%和39.54%。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 見(jiàn)表1。

表1 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響（±s，n = 6）

表1 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響（±s，n = 6）

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

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2.2 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

含100×10-6、75×10-6、50×10-6DDW 的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）培養(yǎng)48 h 對(duì)Hela 細(xì)胞的遷移侵襲能力有抑制作用，與對(duì)照組（150×10-6）相比，75×10-6、50×10-6DDW的抑制作用較為明顯（P < 0.01）。 見(jiàn)圖1。

圖1 低氘水對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

2.3 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞周期的影響

從圖2 可以看出，DDW 對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞周期具有抑制作用，隨著培養(yǎng)基中氘濃度的降低，Hela 細(xì)胞主要表現(xiàn)為G1、G2期靜止或略微增加，S 期逐漸降低；其中，氘濃度為75、50 ppm 的抑制作用較為明顯，S 期明顯減少（P < 0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組Hela 細(xì)胞周期情況（%，±s，n = 3）

表2 各組Hela 細(xì)胞周期情況（%，±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

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2.4 低氘水對(duì)p21 蛋白的表達(dá)的影響

分別用含氘濃度100×10-6、75×10-6、50×10-61640 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）和氘濃度150×10-6的正常1640 培養(yǎng)基（對(duì)照組）處理Hela 細(xì)胞24 h 后，Western blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DDW 能夠明顯上調(diào)宮頸癌Hela 細(xì)胞中p21 蛋白的表達(dá)（圖3）。Hela 細(xì)胞中p21 蛋白在氘濃度為100、75、50 ppm 的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）中表達(dá)灰度值分別為（0.717±0.037）、（0.979±0.082）、（1.146±0.087），與對(duì)照組（0.539±0.042）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖2 低氘水對(duì)Hela 細(xì)胞周期的影響

圖3 Western blot 法檢測(cè)p21 蛋白的表達(dá)

2.5 低氘水對(duì)p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達(dá)的影響

分別用氘濃度為150×10-6普通1640 培養(yǎng)基和氘濃度為50×10-6的1640 培養(yǎng)基處理Hela 細(xì)胞24 h后，免疫組化檢測(cè)p21、Na+/K+-ATPase 蛋白表達(dá)變化。從圖4 中可以看出，經(jīng)過(guò)染色后可以發(fā)現(xiàn)p21 蛋白在氘濃度為50×10-6的1640 培養(yǎng)基中的表達(dá)明顯高于氘濃度為150×10-6正常1640 培養(yǎng)基；而Na+/K+-ATPase在氘濃度為50×10-6的1640 培養(yǎng)基中的表達(dá)明顯低于氘濃度為150×10-6正常1640 培養(yǎng)基。

圖4 免疫組化LP 法檢測(cè)p21、Na+/K+-ATPase 蛋白的表達(dá)

3 討論

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，DDW 可以抑制肺癌、鼻咽癌和肝癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及在延長(zhǎng)癌癥患者生存期方面具有積極的作用[19-23]。 然而目前尚未見(jiàn)低氘水對(duì)宮頸癌的作用研究的相關(guān)報(bào)道。本研究將Hela 細(xì)胞用不同DDW 濃度的培養(yǎng)基處理，用MTT 法、劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到隨著培養(yǎng)基中氘濃度下降，Hela 細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力得到明顯的抑制，在氘濃度為50×10-6的培養(yǎng)基，72 h 的增殖抑制率達(dá)到39.54%（P<0.01）。 劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DDW 對(duì)宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用，同樣在50×10-6時(shí)差異性最明顯（P < 0.01）。Western blot 和免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DDW 能選擇性上調(diào)Hela 細(xì)胞中p21 蛋白的表達(dá)水平， 下調(diào)Na+/K+-ATPase 的表達(dá)。 p21waf基因是p53 基因重要的下游基因之一, 其表達(dá)產(chǎn)物p21 蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白。 p21 可以和p53 共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站。因DNA 損傷后不經(jīng)過(guò)修復(fù)則無(wú)法通過(guò)G1檢查站，減少了受損DNA 的復(fù)制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用。 Sultana 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者對(duì)化療的敏感性是通過(guò)p53-Bax 調(diào)節(jié)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而起作用；先期化療可以促進(jìn)宮頸癌患者CD8+和CD4+陽(yáng)性的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素γ，通過(guò)免疫系統(tǒng)而起作用。 Gy?ngyi 等[25]證實(shí)，DDW 能降低經(jīng)致癌源處理大鼠C-myc、Ha-ras 和p53 基因表達(dá)。 本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含不同氘濃度的培養(yǎng)基對(duì)Hela 細(xì)胞周期的影響。 隨著DDW 氘濃度的降低，主要表現(xiàn)為G1、G2期逐漸 增加，S 期逐漸減少。 這 很可 能 是DDW 選擇性抑制Hela 宮頸癌細(xì)胞株增殖和轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制之一，即通過(guò)p53 介導(dǎo)，有效上調(diào)p21影響細(xì)胞的周期進(jìn)程和凋亡，從而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。 Na+/K+-ATPase 是腫瘤組織異常增生的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Na+/K+-ATPase 活性是顯著升高的。李春曉等[26]及Usta 等[27]研究表明，抑制Na+/K+-ATPase 活力可作為一種新的治療乳腺癌和肝癌的有效手段。 本研究Western blot 和免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)DDW 處理的Hela 細(xì)胞，Na+/K+-ATPase 蛋白明顯下調(diào)。 這些結(jié)果說(shuō)明，降低細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中的氘體積濃度，可以抑制Hela 宮頸癌細(xì)胞株的增殖和轉(zhuǎn)移能力，DDW 具有選擇性抗腫瘤的靶向生物效應(yīng)。

人類(lèi)乳頭狀瘤病毒（HPV）和吸煙是宮頸癌的兩大危險(xiǎn)因素，HPV 感染是最主要的因素，幾乎所有的宮頸癌都與HPV 感染有關(guān)[28]。 宮頸癌的主要治療手段是手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療。 手術(shù)治療主要適用于早期宮頸癌（ⅠA～ⅡA 期）患者。雖然傳統(tǒng)上認(rèn)為，宮頸癌對(duì)化療藥物不敏感，治療方法以手術(shù)和放療為主，但是大量的腫瘤細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)展和臨床實(shí)踐證實(shí)，對(duì)于亞臨床和微小的轉(zhuǎn)移灶手術(shù)和放療并不能完全控制和消除。 因此，作為治療癌癥有效方法之一的化療在宮頸癌的綜合治療中的地位也越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，研究表明，癌細(xì)胞增長(zhǎng)機(jī)制與氘原子有很大的關(guān)系，通過(guò)降低體內(nèi)氘的濃度，可以抑制體內(nèi)癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。因此，DDW 作為新型無(wú)毒副作用抗癌輔助治療劑在腫瘤治療中將具有重要應(yīng)用前景。

[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA： A Cancer Journal for Clinicians，2011，61（2）：69-90.

[2] Forouzanfar MH，F(xiàn)oreman KJ，Delossantos AM，et al.Breast and cervical cancer in 187 countries between 1980 and 2010：a systematic analysis [J]. Lancet，2011，378（9801）：1461-1484.

[3] Zheng BW，Chen CD，Wei AX，et al. Guangdong in 370000 cases of women with uterine cervical cytology test in the screening of cervical lesion studies [J]. The Practical Journal of Cancer，2008，23（3）：248-249.

[4] Horita J，Rozanski K，Cohen S. Isotope effects in the evaporation of water： a status report of the Craig-Gordon model [J]. Isotopes in Environmental and Health Studies，2008，44（1）：23-49.

[5] Gross PR，Spindel W. Mitotic arrest by deuterium oxide [J].Science，1960，131（3392）：37-38.

[6] Brooks SC. Osmotic effects of deuterium oxide（heavy water）on living cells [J]. Science，1937，86（2239）：497-498.

[7] Gross PR，Clifford V. Blockade of deoxyribonucleic acid synthesis by deuterium oxide[J].Science，1961，133（3459）：1131-1133.

[8] Pijima M，Yoshida T，Kato T，et al. Visualization of lateral water transport pathways in soybean by a time of flightsecondary ion mass spectrometry cryo-system [J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（6）：2179-2188.

[9] Lamprecht J，Schroeter D，Paweletz N. Derangement of microtubule arrays in interphase and mitotic PtK2 cells treated with deuterium oxide（heavy water） [J]. Journal of Cell Science，1991，98（Pt4）：463-473.

[10] Rowning BA，Wells J，Wu M，et al. Microtubule-mediated transport of organelles and localization of beta -catenin to the future dorsal side of Xenopus eggs [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（4）：1224-1249.

[11] 何相華，呂加平.恐龍滅絕之謎新解[J].發(fā)明與創(chuàng)新：綜合版，2006，5 （10）： 33-34.

[12] Murphy J，Desaive C，Giaretti W，et al. Experimental results on mammalian cells growing in vitro in deuterated medium for neutron-scattering studies [J]. Journal of Cell Science，1977，25（25）：87-94.

[13] Czajka DM，F(xiàn)inkel AJ，F(xiàn)ischer CS，et al. Physiological effects of deuterium on dogs [J]. The American Journal of Physiology，1961，201（201）：357-362.

[14] Friedman I，Smitgi. Deuterium content of snow cores from sierra nevada area [J]. Science，1970，169（3944）：467-470.

[15] White KO，Watkins WR，Bruce CW，et al. Water vapor continuum absorption in the 3.5-4.0-microm region [J].Applied Optics，1978，17（17）：2711-2720.

[16] Haulicǎ I，Peculea M，Stefǎnescu I，et al. Effects of heavy and deuterium-depleted water on vascular reactivity [J].Romanian Journal of Physiology ：Physiological Sciences，1998，35（1-2）： 25-32.

[17] Bild W，Stefanescu I，Haulica I，et al. Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water [J]. Romanian Journal of Physiology：Physiological Sciences，1999，36（3-4）：205-218.

[18] Bild W，Nǎstasǎ V，Haulicǎ I. In vivo and in vitro research on the biological effects of deuterium-depleted water： 1. Influence of deuterium-depleted water on cultured cell growth [J]. Romanian Journal of Physiology：Physiological Sciences，2004，41（1-2）： 53-67.

[19] Usta J，Kreydiyyeh S，Knio K，et al. Linalool decreases HepG2 viability by inhibiting mitochon drial complexesⅠand Ⅱ，increasing reactive oxygen species and decreasing ATP and GSH levels [J]. Chemico-biological Interactions，2009，180（1）： 39-46.

[20] Somlyai G，Jancsó G，Jákli G，et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells[J].FEBS Letters，1993，317（1-2）：1-4.

[21] Wang HQ，Zhu BH，He ZW，et al. Deuterium-depleted water （DDW）inhibits the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro [J]. Biomedicine& Pharmacotherapy，2013，67（6）：489-496.

[22] 王宏強(qiáng),祝葆華,劉聰,等.低氘水可選擇性抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（10）：1394-1399.

[23] 王坤,祝葆華,王宏強(qiáng),等.低氘水對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，31（3）：241-244.

[24] Sultana H，Kigawa J，Kanamori Y，et al. Chemosensitivity and p53-Bax pathway-mediated apoptosis in patients with uterine cervical cancer [J]. Annals of oncology：official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO，2003，14（2）：214-219.

[25] Gy?ngyi Z，Somlyai G. Deuterium depletion can decrease the expression of C-myc Ha-ras and p53 gene in carcinogen -treated mice [J]. In vivo （Athens，Greece），2000，14（3）：437-439.

[26] 李春曉,李偉,王薇，等.P21 蛋白在不同級(jí)別宮頸組織中的表達(dá)及其與高危HPV 感染相關(guān)性的研究[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18（1）：44-48.

[27] Usta J，Hachem Y，El-Rifai O，et al. Fragrance chemicals lyral and lilial decrease viability of HaCat cells' by increasing free radical production and lowering intracellular ATP level： protection by antioxidants [J]. Toxicology in vitro ： An International Journal Published in Association with BIBRA，2013，27（1）：339-348.

[28] Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al. Human papillomavirus and cervical cancer[J].Lancet，2007，370（9590）：890-907.