微生物合成共軛亞油酸機理和方法的研究進展

李 垚，徐爾尼，楊 欣，胡冰彬

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

微生物合成共軛亞油酸機理和方法的研究進展

李 垚，徐爾尼*，楊 欣，胡冰彬

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

共軛亞油酸是人類近年來發(fā)現(xiàn)的最重要的功能性脂肪酸之一，作為一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素，已被廣泛的應(yīng)用到藥品和食品中，應(yīng)用范圍正不斷擴大。本文系統(tǒng)地總結(jié)目前微生物合成共軛亞油酸的研究現(xiàn)狀，闡述生物合成共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的重要性，列舉一些合成CLA的重要菌種，總結(jié)不同微生物合成CLA的機制，對比4種微生物合成方法的特點，展望微生物合成CLA的未來研究方向。

微生物；共軛亞油酸；機理；方法

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是指一系列含有共軛雙鍵、具有不同位置和空間構(gòu)型的十八碳二烯酸同分異構(gòu)體的混合物，其中最具有生理活性的異構(gòu)體是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。CLA是人類近年來發(fā)現(xiàn)的最重要的功能性脂肪酸之一，從抗癌到預(yù)防心血管疾病、糖尿病，甚至體質(zhì)量的控制等[1]，現(xiàn)已成為生活在21世紀現(xiàn)代人不可或缺的健康食品。由于CLA是被應(yīng)用到藥品和食品中，因此一種安全且活性異構(gòu)體含量高的合成方法是迫切需要的，而利用微生物合成CLA可以很好的解決這個難題。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌利用亞油酸合成CLA，只有幾個單一的反應(yīng)，合成的CLA主要是c9,t11和t9,t11-十八碳二烯酸，而且乳酸菌細胞膜上存在的亞油酸異構(gòu)酶，可以細胞形式反應(yīng)，也可以游離酶的形式進行反應(yīng)生產(chǎn)CLA。

1 有合成CLA能力的微生物菌種

目前人們已經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)了14個屬250多株菌具有合成CLA的能力，這些菌屬于腸球菌屬、片球菌屬、丙酸菌屬、乳桿菌屬等[2]，合成CLA轉(zhuǎn)化率高的微生物分別是瘤胃細菌，丙酸菌和乳酸菌等[3]。乳制品是CLA最主要的天然來源，c9,t11-CLA是其主要異構(gòu)體[4]，這與瘤胃細菌合成有關(guān)，例如反芻動物瘤胃中厭氧溶纖維丁酸弧菌屬合成的c9,t11-CLA可能是亞油酸生物氫化合成硬脂酸過程中的一個中間產(chǎn)物[5]。Jiang等[6]研究發(fā)現(xiàn)費氏丙酸桿菌可以轉(zhuǎn)化亞油酸合成CLA。Rainio等[7]研究表明費氏丙酸桿菌在對數(shù)期合成CLA的量很多，其中c9,t11占85%～95%。表1總結(jié)了目前發(fā)現(xiàn)的可以轉(zhuǎn)化亞油酸合成CLA的微生物菌種，它們大都是厭氧或者兼性厭氧菌，在含有亞油酸的培養(yǎng)基中生長合成CLA，一些菌的靜息細胞也可以催化亞油酸合成CLA，其中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌是最有潛力的兩個菌種。靜息細胞轉(zhuǎn)化法是指將微生物培養(yǎng)至一定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于不完全培養(yǎng)基（缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)，如氮源等）中，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，再加入底物，在適當?shù)臏囟取H值和振蕩條件下進行轉(zhuǎn)化的方法，它是一種將生長影響減至最小的生物轉(zhuǎn)化方法。

表1 不同微生物菌種合成CLA特點的比較Table 1 Comparison of CLA produced by different microorganisms

2 微生物合成CLA機理

CLA是亞油酸生物氫化過程中的中間產(chǎn)物，此過程主要由厭氧菌來完成，由于游離多不飽和脂肪酸能抑制厭氧菌的生長，因此，推測這個飽和反應(yīng)可能是這類細菌自發(fā)的一個解毒作用[3]。由表1可知，幾乎所有菌種都能生產(chǎn)c9,t11和t9,t11兩種異構(gòu)體，但是，控制異構(gòu)體的比例仍舊顯得很重要，研究發(fā)現(xiàn)改變反應(yīng)條件可以控制異構(gòu)體的比例。例如，添加絲氨酸、葡萄糖、硝酸銀、氯化鈉，可以減少t9,t11產(chǎn)生，導(dǎo)致選擇性的合成c9,t11[18]。如果這個反應(yīng)體系中亞油酸濃度很低，持續(xù)反應(yīng)一段時間后，97%以上都是t9,t11[14]。在此我們綜述了不同微生物合成CLA的作用機理。

2.1 丁酸弧菌在哺乳動物體內(nèi)合成CLA機理

乳制品之所以含有較多的c9,t11-CLA，是因為牛、羊等哺乳動物體內(nèi)一些瘤胃細菌的作用。Kepler等[19]在1967年發(fā)現(xiàn)瘤胃中溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）細胞膜上有亞油酸異構(gòu)酶，即使在有氧條件下也能繼續(xù)合成c9,t11-CLA，酶催化速率較快，可適應(yīng)較寬的pH值范圍。c9,t11-CLA是該菌在亞油酸生物氫化為硬脂酸過程中的一個中間產(chǎn)物，這個過程至少有兩個反應(yīng)，如圖1所示。首先亞油酸異構(gòu)化為c9,t11-CLA，接著共軛雙鍵加氫成為t11-十八碳一烯酸（trans-vaccenic acid），逐漸形成了單烯酸和生物氫化產(chǎn)生的共軛亞油酸混合物，最后單烯酸在哺乳動物細胞內(nèi)’9去飽和酶的作用下轉(zhuǎn)化形成c9,t11-CLA，如圖2所示。研究發(fā)現(xiàn)，一些霉菌細胞內(nèi)也存在’9去飽和酶，可以把t11-十八碳一烯酸轉(zhuǎn)化為CLA[20]。雖然多種瘤胃菌均能催化LA轉(zhuǎn)化成CLA，并且是以c9,t11-CLA為主的CLA的混合物，但瘤胃菌的培養(yǎng)需要嚴格的厭氧條件，不易培養(yǎng)，因此限制了在生產(chǎn)上的應(yīng)用。

圖1 丁酸弧菌氫化亞油酸為硬脂酸的途徑[[33]]Fig.1 Proposed pathway of linoleic acid hydrogenation to stearic acid by Butyrivibrio fi brisolvens[3]

圖2 Δ 9去飽和酶作用于十八碳一烯酸合成CLLAA[[33]]Fig.2 CLA production from trans-vaccenic acid through Δ9 desaturation[3]

2.2 嗜酸乳桿菌以亞油酸為底物合成CLA機理

圖3 嗜酸乳桿菌異構(gòu)化亞油酸為CLA的途徑[[33]]Fig.3 Proposed pathway of linoleic acid isomerization to CLA by Lactobacillus acidophilus[3]

Ogawa等[13]研究了嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）AKU1137以亞油酸為底物合成CLA的反應(yīng)機制。這個反應(yīng)與羥基脂肪酸的形成有關(guān)，隨著這個反應(yīng)的持續(xù)進行，羥基脂肪酸的積累量會迅速下降，并伴隨著CLA產(chǎn)量的增加。這個結(jié)果顯示了羥基脂肪酸是嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化亞油酸生產(chǎn)CLA過程中的一個中間產(chǎn)物，見圖3。

2.3 植物乳桿菌以蓖麻油為底物合成CLA機理

蓖麻油富含蓖麻油酸，總脂肪酸中的88%是蓖麻油酸，乳酸菌只可以利用游離蓖麻油酸合成CLA。在蓖麻油中，大部分蓖麻油酸以三酰甘油形式存在，因此，在反應(yīng)體系中，脂肪酶的存在可以催化蓖麻油水解為游離的蓖麻油酸，從而被乳酸菌利用，見圖4。研究發(fā)現(xiàn)非離子表面乳化劑，特別是多羥基乳化劑（如Lubrol PX）可以很好的分散蓖麻油，有利于CLA的生成。Ando等[16]研究了利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JCM 1551作為轉(zhuǎn)化細胞酶生產(chǎn)CLA。在微氧、37℃的條件下，以1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH6.5）為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，以蓖麻油酸乳化劑（蓖麻油酸與Lubrol PX質(zhì)量比5∶1為底物，底物質(zhì)量濃度為5mg/mL，其菌液質(zhì)量濃度是12g/100mL，反應(yīng)99h。CLA合成量達2mg/mL，占提取到總脂肪酸含量的46%，并由c9,t11 （26%）和t9,t11（74%）兩部分組成，其中37%的CLA積累在細胞表面內(nèi)外，主要以游離形式存在。沒有反應(yīng)的蓖麻油在上清液中被發(fā)現(xiàn)，也主要以游離形式存在。

圖4 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化蓖麻油和蓖麻油酸為CLA的途徑[3]Fig.4 Proposed pathway of ricinoleic acid and castor oil transformation to CLA by Lactobacillus plantarum[3]

2.4 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成共軛多不飽和脂肪酸機理

各種各樣帶有共軛雙鍵的脂肪酸在生物體內(nèi)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，近幾年，人們發(fā)現(xiàn)不僅CLA，還有共軛三烯酸都有獨特的生理活性，α-亞麻酸經(jīng)過堿異構(gòu)可以形成共軛三烯酸，它對人類癌細胞的生長有抑制作用[21]。Kishino等[22]研究了利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）AKU 1009a細胞轉(zhuǎn)化不同種類多不飽和脂肪酸形成共軛脂肪酸，見表2。其中α-亞麻酸（c9,c12,c15-18∶3），γ-亞麻酸（c6,c9,c12-18∶3），松籽油酸（c5,c9,c12-18∶3）和十八碳四烯酸（c6,c9,c12,c15-18∶4）都可以被轉(zhuǎn)化為共軛脂肪酸。

表2 植物乳桿菌AKU 1009a轉(zhuǎn)化多不飽和脂肪酸[2]Table 2 Transformation of polyunsaturated fatty acids by L. plantarum AKU 1009a[2]

由表2可知，可以利用植物乳酸菌進行轉(zhuǎn)化形成共軛雙鍵的脂肪酸都是帶有c9,c12雙鍵的十八碳二烯酸，可利用α-亞麻酸生產(chǎn)共軛α-亞麻酸（conjugated alphalinolenic acid，CALA）的3種主要脂肪酸結(jié)構(gòu)分別是：c9,t11,c15-18∶3，t9,t11,c15-18∶3和t10,c15-18∶2；可利用γ-亞麻酸生產(chǎn)共軛γ-亞麻酸（conjugated gammalinolenic acid，CGLA）的4種主要脂肪酸結(jié)構(gòu)分別是：c6,c9,t11-18∶3，c6,t9,t11-18∶3，c6,t10-18∶2和t10-18∶1。利用α-亞麻酸進行轉(zhuǎn)化的過程發(fā)現(xiàn)在初級階段，c9,t11,c15-18∶3和t9,t11,c15-18∶3共軛三烯酸（conjugate three acid，CTA）被積累，隨著反應(yīng)的進行，積累的共軛三烯酸逐漸減少，t10,c15-十八碳二烯酸的含量則不斷增加。類似的結(jié)果也可以在利用γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化形成CGLA的過程中被發(fā)現(xiàn)，見圖5。

圖5 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化α--和γ-亞麻酸的途徑[[22]]Fig.5 Proposed pathway of α- and γ-linolenic acid transformation by Lactobacillus plantarum[2]

3 微生物合成CLA的方法

目前，人們主要是研究利用乳酸菌生產(chǎn)共軛亞油酸，大體上有活細胞發(fā)酵法、酶法合成、靜息細胞轉(zhuǎn)化法與固定化細胞合成法4種方法，它們有著各自的特點，其中靜息細胞轉(zhuǎn)化合成是目前研究最多的方法。

3.1 活細胞發(fā)酵法

2002年，Kim等[23]研究了發(fā)酵乳中有14種乳酸菌具有利用向日葵油合成CLA的能力，其中乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）I-01表現(xiàn)出最高的合成能力，當向日葵油的質(zhì)量濃度為0.1 g/L時產(chǎn)生的CLA量最大，而向日葵油的質(zhì)量濃度大于0.2 g/L時，CLA的生成量逐漸減少。Oh等[24]研究了短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）和假鏈狀雙歧桿菌（Bifi dobacterium pseudocatenulatum）發(fā)酵生產(chǎn)CLA，研究表明，培養(yǎng)30 h細胞量達到最高，產(chǎn)生的異構(gòu)體主要是c9,t11-CLA，并分布在上清液中，產(chǎn)量分別是160 mg/L和135 mg/L。劉曉華等[25]利用瑞士乳桿菌（L. helveticus）L7發(fā)酵生產(chǎn)CLA，MRS培養(yǎng)基中接入5%的菌種，加入亞油酸至質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL，30℃發(fā)酵培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液萃取后，經(jīng)紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析測試，確定了該菌生物轉(zhuǎn)化形成的兩種主要異構(gòu)體是t9,t11-CLA和c9,t11-CLA。

3.2 酶法合成CLA

亞油酸異構(gòu)酶很難分離、純化，熱穩(wěn)定性差，提取過程中，酶很容易失活。Lin等[26]用MRS肉湯培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，離心收集細胞后，依次用溶菌酶和超聲波破壁，離心收集粗酶，再經(jīng)鹽析、透析，然后用孔徑0.22 μm的膜過濾，離心濃縮，最后用分子質(zhì)量大于100 kD的膜收集目的酶，達到了較好的純化效果。Peng[27]、Rosson[28]等通過鹽析，陰離子交換層析（DEAE-SPW色譜柱）、聚焦色譜、凝膠過濾層析（1.6 cm×55 cm，Superdex-200色譜柱）等純化方法，分別獲得了C.sporogemes、L.reuteri、P.acnes共3株菌的亞油酸異構(gòu)酶，其酶比活力是粗酶活性的350～480倍。SDS-PAGE電泳分析表明，C.sporogemes亞油酸異構(gòu)酶的分子質(zhì)量大約為45 kD，L.reuteri的大約是68 kD、P.acnes的大約是55 kD。Lin[11]研究對比了德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）洗滌細胞和粗酶轉(zhuǎn)化亞油酸形成CLA的效果。結(jié)果顯示，洗滌細胞轉(zhuǎn)化合成CLA的產(chǎn)量是209 μg/mL，而提取粗酶催化合成的產(chǎn)量是8.5 μg/mL，并且單個異構(gòu)體的含量和總CLA的含量大大低于洗滌細胞的轉(zhuǎn)化，這可能與游離的亞油酸異構(gòu)酶穩(wěn)定性較差，經(jīng)提取處理后酶活力降低有關(guān)。

3.3 靜息細胞轉(zhuǎn)化法

由于采用提取后的亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化LA合成CLA存在酶不穩(wěn)定、酶活下降等缺陷，所以利用乳酸菌靜息細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)CLA成為近幾年研究的熱點。許多研究表明[11]，利用乳酸菌洗滌細胞在微氧條件下轉(zhuǎn)化合成CLA具有更好的發(fā)展前景，原因有6點：1）洗滌細胞處于休眠狀態(tài)，可以作為亞油酸異構(gòu)酶的天然透析袋，免去了酶提取純化的繁瑣過程；2）反應(yīng)只需在適宜的介質(zhì)體系條件下進行；3）生成的反應(yīng)產(chǎn)物是具有生理活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA；4）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單一，CLA能以高濃度積累；5）洗滌細胞可以達到很高的密度，比發(fā)酵法的細胞密度高出十多倍；6）產(chǎn)物CLA以游離形式積累在細胞外，易于提取。Raino[29]2001年利用丙酸菌（Propionibacterium freudenreichi）在加乳清的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，經(jīng)洗滌收集細胞，再放入含有4.0 mg/mL亞油酸的磷酸鹽緩沖液中進行靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率達到了46%，這是當時報道的利用洗滌細胞反應(yīng)轉(zhuǎn)化合成CLA的最高產(chǎn)率。許慶炎等[30]篩選了一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZS2058，以磷酸鉀緩沖液為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，在亞油酸質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL、細胞濃度為4×1010CFU/mL、37℃、pH 6.5的條件下，轉(zhuǎn)化24 h。c9,t11-CLA產(chǎn)量是374 μg/mL，CLA總量為491 μg/mL，轉(zhuǎn)化率可達到60.54%。Zhao等[31]利用凍融法對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A6-1F進行透性化處理，然后采用該凍融細胞轉(zhuǎn)化合成CLA。在以磷酸鹽緩沖溶液為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，pH 7.0、細胞質(zhì)量濃度為15 g/100 mL、亞油酸質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL、37℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)2h條件下，CLA最高產(chǎn)量可以達到275.7 μg/mL，比不進行透性化處理的產(chǎn)量提高了將近20%，主要異構(gòu)體是c9,t11-CLA。

3.4 固定化細胞合成法

Lee等[32]將羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）ATCC 55739固定在硅膠上，在亞油酸質(zhì)量濃度為500mg/L、pH10.5、55℃的條件下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)1 h，可生成175 mg/L的CLA，轉(zhuǎn)化率為35%。而游離洗滌細胞在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)1 h，僅產(chǎn)生32 mg/mL，轉(zhuǎn)化率為6.4%，固定化細胞CLA轉(zhuǎn)化率是游離細胞的5.5倍。Lin等[33]分別利用殼聚糖和聚丙烯酰胺兩種材料，對德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）CCRC14009和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CCRC14079進行混菌固定化。在pH 7的條件下，聚丙烯酰胺固定化細胞的CLA產(chǎn)量是121 μg，殼聚糖的是51.2 μg，而游離細胞的產(chǎn)量只有29.4 μg。王歡等[34]研究了以海藻酸鈉為載體，采用包埋法制備固定化干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），在最適條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)18 h，CLA積累量為62.57 μg/mL。而游離乳酸菌在相同條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)18 h，CLA積累量僅為50 μg/mL。在固定化乳酸菌與游離乳酸菌均達到最大產(chǎn)量CLA時，固定化的乳酸菌比游離菌所用的轉(zhuǎn)化時間短，且CLA積累量多。這說明固定化更有利于實現(xiàn)高產(chǎn)量的連續(xù)生產(chǎn)和菌體的重復(fù)利用，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。

3.5 4種轉(zhuǎn)化合成CLA方法的比較

表3 4種轉(zhuǎn)化合成CLA方法的比較Table 3 Comparison of four methods for CLA biosynthesis

由表3可知，活細胞發(fā)酵法操作簡單，但是易染菌，細胞量低，轉(zhuǎn)化率低；酶法合成雖然反應(yīng)快，產(chǎn)物易分離，但是操作復(fù)雜，酶易失活，成本較高；靜息細胞轉(zhuǎn)化法不易染菌，干擾物質(zhì)少，產(chǎn)物易分離，同時免去了酶的提??；固定化細胞合成法可以批次連續(xù)反應(yīng)，成本低，產(chǎn)量高，隨著批次的延續(xù)酶活逐漸下降。綜上所述，靜息細胞轉(zhuǎn)化法和固定化細胞技術(shù)結(jié)合是目前我們應(yīng)該考慮的一個方向。

4 結(jié) 語

隨著人們生活水平的不斷提高，人們的保健意識會持續(xù)增強，因此，具有獨特生理活性共軛亞油酸將會一直受到人們的青睞，其市場需求量也會不斷提高。微生物合成共軛亞油酸雖然有很多優(yōu)勢，但是現(xiàn)在還遠遠不能滿足人們的需求，所以，提高微生物合成共軛亞油酸的產(chǎn)量是一項任重而道遠的歷程。

我們應(yīng)該從選育菌株，優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝，改進固定化技術(shù)，尋找亞油酸替代品等方面入手。即利用紫外誘變、基因工程等手段篩選產(chǎn)量更高的優(yōu)良菌株；對細胞進行透性化處理，使底物與亞油酸異構(gòu)酶易結(jié)合進行反應(yīng)；給反應(yīng)體系中添加抗氧化劑等方式減少CLA氧化；結(jié)合固定化技術(shù)使亞油酸細胞酶可以得到重復(fù)、多批次利用，從而達到高效率、低成本生產(chǎn)的目的。另一方面，我們應(yīng)該尋找更廉價、易得的亞油酸替代品，比如紅花籽油、蓖麻油、葵花籽油、海蓬籽油、苜蓿籽油等一些富含亞油酸的油脂經(jīng)過水解和脂肪酶的處理都可以作為合成CLA的底物。

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Progress in Mechanism and Methods for Microbial Synthesis of Conjugated Linoleic Acid

LI Yao, XU Er-ni*, YANG Xin, HU Bing-bin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Conjugated linoleic acid (CLA) is one of the most important functional lipids found in recent years. As a newlyfound nutrient, CLA has been widely applied to medicine and food and its applications are currently extended in other fields as well. This review systematically summarizes the recent studies on microbial production of CLA, expoundes the significance of CLA biosynthesis, enumerates the important strains to synthetize CLA, summarizesthe different mechanisms for the synthesis of CLA by different microorganisms, compares the features of four methods for its microbial synthesis, and finally presumes the potential trends to synthesize CLA by microorganisms in the future.

microorganism; conjugated linoleic acid; mechanism; method

Q939.9

A

1002-6630(2014)01-0271-06

10.7506/spkx1002-6630-201401054

2012-11-18

江西省科技廳科技支撐計劃項目（20111BBF60024）

李垚（1987—），男，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：liyao19870108@163.com

*通信作者：徐爾尼（1956—），女，教授，學(xué)士，研究方向為應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：xuerni@126.com