HMGB1、NF－κBp65、MMP2在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

劉桂云 滕學(xué)芹 于 輝

（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東253023）

子宮內(nèi)膜癌（endometrialcar cinoma，EC）是原發(fā)于子宮內(nèi)膜（proliferative endometrium）的一組上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%－30%，占女性全身惡性腫瘤的6%［1］，其中約90%起源于內(nèi)膜腺體，又稱子宮內(nèi)膜腺癌。近年來(lái)在全世界發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，2010年美國(guó)有43000新發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者［2］。近年來(lái)腫瘤特異性的調(diào)亡抑制因子，如高遷移 率 族 蛋 白 （high－mobility group protein1，HMGB1）、核因子－κB（nuclear factor－kappaB，NF－κBp65）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）單個(gè)在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中的作用成為研究的熱點(diǎn)，HMGB1、NF－κBp65、MMP2各自也有許多研究成果［3，4］，但是三者同時(shí)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)二步法對(duì)126例標(biāo)本進(jìn)行 HMGB1、NF－κBp65、MMP2表達(dá)情況檢測(cè)并分析其在子宮內(nèi)膜腺癌表達(dá)的相關(guān)性，探討HMGB1、NF－κBp65、MMP2在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義，旨在為子宮內(nèi)膜腺癌的早期診斷及臨床治療提供潛在的新途徑。

材料和方法

1．材料

收集2009年1月至2013年6月德州市人民醫(yī)院婦科手術(shù)的子宮內(nèi)膜組織存檔蠟塊126個(gè)。其中子宮內(nèi)膜癌66例，年齡范圍37－72歲，平均53．9歲；不典型增生性子宮內(nèi)膜36例，年齡范圍47－61歲，平均年齡52歲；選取同期其他原因進(jìn)行診斷性刮宮獲得正常增生期子宮內(nèi)膜24例，年齡范圍33－51歲，平均年齡43．3歲。所有子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本患者術(shù)前均未接受放療、化療。

2．HE染色

每個(gè)蠟塊均制7張切片（5張用于免疫組化染色、2張用于HE染色）常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色4min，5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，伊紅復(fù)染30S，脫水、透明、封片、鏡檢。

3．免疫組織化學(xué)染色

免疫組化染色按二步法試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，直接煮沸法抗原修復(fù)37℃溫箱孵育，用磷酸緩沖洗液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照，用己知子宮內(nèi)膜癌陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。以便較為確切而客觀地反映檢測(cè)結(jié)果。顯微鏡下觀察。

4．診斷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）1988年手術(shù)－病理分期標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有內(nèi)膜癌病理切片進(jìn)行詳細(xì)分級(jí)，手術(shù)一病理分期I期50例（其中Ia期32例，Ib期18例），Ⅱ期8例，Ⅲ、Ⅳ期8例。FIGO分期：高分化（Gl期）48例，中分化（G2期）12例，低分化（G3期）6例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例；子宮內(nèi)膜癌病理組織學(xué)分型：腺癌65例，漿液性乳頭狀囊腺癌1例。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HMGB1、NF－κBp65和 MMP2均以細(xì)胞漿內(nèi)有黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按有無(wú)著色及著色深淺依次分級(jí)：無(wú)著色為（一），淡黃色為（＋），黃色為（＋＋），棕黃色為 （＋＋＋）。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17．0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，校正χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher′s確切概率等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01有顯著性差異。

結(jié) 果

1．HMGB1、NF－κBp65和 MMP2在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生性子宮內(nèi)膜、正常增生期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

1．1HMGB1蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生性子宮內(nèi)膜、正常增生期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

HMGB1蛋白表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和腺上皮胞核及胞漿中，呈棕黃色。HMGB1在正常增生期子宮內(nèi)膜中基本呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為25%。在不典型增生性子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為55．56%。在子宮內(nèi)膜癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為78．79%（圖1，2）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組與正常組比較HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率有明顯差異（P＜0．05），子宮內(nèi)膜癌組與不典型增生性子宮內(nèi)膜組比較HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率有明顯差異（P＜0．05），見(jiàn)表1。

表1 HMGB1在不同類型子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)Table 1 HMGB1expression in different types of endometrial tissue

1．2NF－κBp65蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生性子宮內(nèi)膜、正常增生期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

NF－κBp65蛋白在癌細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的胞漿和（或）胞核中表達(dá)，以胞漿為主（圖3，4）。24例正常增生期子宮內(nèi)膜均為陰性表達(dá)；36例不典型增生性子宮內(nèi)膜中有14例（38．89% ）陽(yáng)性表達(dá)；66例子宮內(nèi)膜腺癌中有42例（63．64%）陽(yáng)性表達(dá)，子宮內(nèi)膜樣腺癌與正常增生期子宮內(nèi)膜組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與不典型增生性子宮內(nèi)膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表2。

表2 NF－κBp65在不同類型子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)Table 2 NF－κBp65expression in different types of endometrial tissue

1．3MMP2蛋白在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生性子宮內(nèi)膜、正常增生期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

MMP2主要表達(dá)于癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿，呈淡黃色、黃色或棕黃色顆粒（圖5，6）。MMP2在正常子宮內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為8．33%；在不典型增生性子宮內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為50．00%；子宮內(nèi)膜癌組織中MMP2的陽(yáng)性表達(dá)率為71．21%，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，差異有顯著性差異（P＜0．05），見(jiàn)表3。

表3 MMP2在不同類型子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)Table 3 MMP2expression in different types of endometrial tissue

2．HMGB1、NF－κBp65和 MMP2在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

2．1HMGB1和 NF－κBp65表達(dá)的相關(guān)性

在本實(shí)驗(yàn)研究中66例子宮內(nèi)膜癌中，其中52例HMGB1陽(yáng)性表達(dá)中，36例NF－κBp65陽(yáng)性表達(dá)，16例NF－κBp65陰性表達(dá)；14例 HMGB1陰性表達(dá)中6例NF－κBp65陽(yáng)性表達(dá)，8例NF－κBp65陰性表達(dá)。NF－κBp65與HMGB1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)為正相關(guān)關(guān)系（r＝0．67）。

2．2HMGB1與MMP2表達(dá)的相關(guān)性

在本實(shí)驗(yàn)研究中66例子宮內(nèi)膜癌中，其中52例HMGB1陽(yáng)性表達(dá)中，37例MMP2陽(yáng)性表達(dá)，15例MMP2陰性表達(dá)；14例HMGB1陰性表達(dá)中10例MMP2陽(yáng)性表達(dá)，4例 MMP2陰性表達(dá)。HMGB1與MMP2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)為正相關(guān)關(guān)系（r＝0．41）。

2．3NF－κBp65與 MMP2表達(dá)的相關(guān)性

在本實(shí)驗(yàn)研究中66例子宮內(nèi)膜癌中，其中42例NF－κBp65陽(yáng)性表達(dá)中，30例MMP2陽(yáng)性表達(dá)，12例MMP2陰性表達(dá)；24例NF－κBp65陰性表達(dá)中17例MMP2陽(yáng)性表達(dá)，7例MMP2陰性表達(dá)。NF－κBp65與MMP2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)為正相關(guān)關(guān)系（r＝0．36）。

討 論

HMGB1包含215個(gè)氨基酸殘基，因其分子質(zhì)量小，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得名，是低分子量非組DNA結(jié)合蛋白。Fu等［5］經(jīng)免疫組化及 Western blot分析證實(shí)，HMGB1在宮頸鱗癌組織中，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，可作為宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要判定指標(biāo)之一。曾有研究結(jié)果表明，HMGB1的表達(dá)與肺癌組織病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為肺癌轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后判斷指標(biāo)［6］，馬本紅等［7］報(bào)道HMGB1在子宮內(nèi)膜腺癌及癌前病變中表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究HMGB1在子宮內(nèi)膜癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為78．79%，不典型增生性子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率為55．56%。正常增生期子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性率為25．00%，不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌組織免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性率明顯高于正常內(nèi)膜組織，差異顯著，這與以上報(bào)道一致。這提示HMGB1可能參與了子宮內(nèi)膜腺癌及癌前病變的發(fā)生和發(fā)展。

NF－κB是一種多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，蛋白家族成員較多，其中NF－κBp65表達(dá)于大多數(shù)惡性腫瘤，包括頸部腫瘤、消化道腫瘤、宮頸及乳腺癌等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的聯(lián)系［8，9］。嚴(yán)艷等［10］報(bào)道 NF－κBp65蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌、不典型子宮內(nèi)膜增生及正常增生期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)率分別為65．8%、36．70%和0．00%，子宮內(nèi)膜樣腺癌中NF－κBp65蛋白的表達(dá)率顯著高于不典型增生子宮內(nèi)膜，（P＜0．05）；我們通過(guò)免疫組化法檢測(cè)核因子－κBp65，發(fā)現(xiàn)正常增生期子宮內(nèi)膜均為陰性表達(dá)，不典型增生性子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)率38．89%，與正常增生期子宮內(nèi)膜組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；子宮內(nèi)膜腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率為63．64%，與不典型增生性子宮內(nèi)膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。推測(cè)NF－κBp65是子宮內(nèi)膜癌早期被激活的一種癌蛋白，在子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，廣泛參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［11］。

Weigel等［12］研究認(rèn)為與正常及異位的子宮內(nèi)膜組織比較，子宮內(nèi)膜癌組織中MMP－9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。Di Nezza［13］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) MMP2在正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織中的表達(dá)率很低為13．6%，在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)率較之正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織明顯增高，為76．7%。本組研究顯示，MMP2正常子宮內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為8．33%，在不典型增生性子宮內(nèi)膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為50．00%，66例子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)MP2的陽(yáng)性表達(dá)率為71．21%。在由正常增生期子宮內(nèi)膜一不典型增生內(nèi)膜一子宮內(nèi)膜癌形成的過(guò)程中MMP2的表達(dá)也呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本文與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。提示MMP2的檢測(cè)可能作為子宮內(nèi)膜癌早期診斷有價(jià)值的分子生物學(xué)指標(biāo)。

HMGB1、NF－κBp65、MMP2之間表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果表明：在子宮內(nèi)膜癌組織中HMGB1與NF－κBp65呈正相關(guān) （P＜0．05），HMGB1的高表達(dá)伴NF－κBp65的高表達(dá)可能提示在子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞從正常到癌變的過(guò)程中，HMGB1的過(guò)表達(dá)可增加NF－κB活性，并導(dǎo)致NF－κB的靶基因產(chǎn)物與抗細(xì)胞調(diào)亡蛋白C－IAP的體外過(guò)表達(dá)。C－IAP2是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白，可能是HMGB1激活核因子NF－κB的正調(diào)節(jié)產(chǎn)物，HMGB1和NF－κBp65共同參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。從試驗(yàn)結(jié)果中看出：NF－κBp65與MMP2的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中也呈正相關(guān)，這與 Das［14］報(bào)道相符合，NF－κB可以誘導(dǎo)金屬蛋白酶MMP2，提高細(xì)胞侵襲力，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。HMGB1蛋白的表達(dá)與MMP2的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中也呈正相關(guān)，Volz［15］推測(cè)HMGB1發(fā)揮作用的方式為與其配體RAGE結(jié)合，激活了MAPK信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)骨架重組，并通過(guò)激活細(xì)胞外AKT等活性及核因子NF－κB等信號(hào)通路，使MMP－2和MMP－9活化，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

總之，HMGB1、NF－κBp65、MMP2與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且在子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移、侵襲等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。臨床上能夠在常規(guī)檢測(cè)ER、PR 的同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè) HMGB1、NF－κBp65和MMP2，敏感度會(huì)明顯增高，對(duì)于可疑癌早期診斷、判斷子宮內(nèi)膜癌的惡性程度及預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)歸有重要的臨床意義。

圖 版 說(shuō) 明

圖1 HMGB1在正常增生期子宮內(nèi)膜中的陰性表達(dá)（SP×100）

圖2 HMGB1在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)（SP×100）

圖3 NF－κBp65在不典型增生性子宮內(nèi)的弱陽(yáng)性表達(dá)（SP×100）

圖4 NF－κBp65在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)（SP×100）

圖5 MMP2在正常增生期子宮內(nèi)膜中的弱陽(yáng)性表達(dá)（SP×100）

圖6 MMP2在子宮內(nèi)膜癌中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（SP×100）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1HMGB1negative expression in normal proliferative endometrium，（SP×100）．

Fig．2HMGB1in endometrium cancer compartment positive expression，（SP×100）．

Fig．3The weak positive expression of NF－κBp65dysplasia temper in utero，（SP×100）．

Fig．4NF－κBp65in endometrium cancer compartment masculine expression，（SP×100）．

Fig．5MMP2weak positive expression in normal proliferative endometrium，（SP×100）．

Fig．6MMP2strongly positive expression in endometrial carcinoma，（SP×100）．

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