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    兩種切片方法檢測(cè)肝糖原染色效果的比較

    2014-01-17 12:21:48張繼太張盛周
    關(guān)鍵詞:品紅糖原冰凍

    張繼太 祝 雪 張盛周

    (安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蕪湖241000)

    肝糖原是人和動(dòng)物體內(nèi)的貯備多糖,有“動(dòng)物淀粉”之稱,肝糖原在酶促作用下合成和分解以維持血糖濃度穩(wěn)定。檢測(cè)肝糖原含量變化在醫(yī)學(xué)病理學(xué)上可用于糖原累積病﹑糖尿病和某些腫瘤的診斷[1],在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中可用于了解動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況以指導(dǎo)合理飼喂。高碘酸希夫氏 (periodic acid-Schiff′s,PAS)染色法是檢測(cè)糖原的經(jīng)典組織化學(xué)方法,該法先用高碘酸將糖類相鄰兩個(gè)碳上的羥基氧化成醛基,再用Schiff's試劑(無(wú)色品紅)和醛基反應(yīng)產(chǎn)生紅色或紫紅色物質(zhì),紅色的深淺反映組織細(xì)胞中糖原的含量。目前對(duì)肝糖原PAS染色過(guò)程中樣品固定、染色試劑的配制與儲(chǔ)存、染色時(shí)間等方面研究報(bào)道較多[2-4],切片方法均為石蠟切片,冰凍切片制作過(guò)程時(shí)間短、效率高,但尚未見有關(guān)用冰凍切片檢測(cè)肝糖原的研究報(bào)道。

    牛蛙屬經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖型蛙類,具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也是重要的科研和教學(xué)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本試驗(yàn)分別制作了牛蛙肝組織石蠟和冰凍切片,采用PAS染色法檢測(cè)肝糖原,通過(guò)光密度分析測(cè)定糖原含量,比較了兩種切片的染色效果,供相關(guān)教學(xué)與科研技術(shù)人員參考。

    材料和方法

    1.材料

    成體牛蛙3只,重250-300g,購(gòu)自蕪湖市黃山菜市場(chǎng),穿刺脊髓處死,迅速解剖,取出肝臟,用吸水紙輕輕拭干,勿用水或生理鹽水清洗。

    2.實(shí)驗(yàn)方法

    2.1石蠟切片

    將肝臟切成約1cm×1cm×0.5cm的小塊,用Carnoy固定液于低溫4℃固定約4h,分別用95%乙醇和無(wú)水乙醇脫水2h、二甲苯透明、浸蠟、包埋,常規(guī)切片厚5μm,水中展片。

    2.2冰凍切片

    將肝臟切成約0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊,放在組織支撐器上,滴加冷凍包埋劑后放入冰凍切片機(jī)中低溫固化后切片,切片厚5μm。

    2.3PAS染色

    對(duì)照組取石蠟切片常規(guī)脫蠟至50%乙醇后稍水洗,與冰凍切片同時(shí)滴加唾液淀粉酶溶液于37℃溫箱中消化處理30min,消化過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組石蠟切片脫蠟至50%乙醇后稍水洗,將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的石蠟、冰凍切片入0.5%高碘酸氧化7min,流水沖洗5min再用蒸餾水浸洗兩次;冰箱取出無(wú)色品紅待至室溫后避光染色15-20min;用0.5%的偏重亞硫酸鈉漂洗兩次,每次約1min,流水沖洗5min,蒸餾水洗后 Harris蘇木精染色2min;自來(lái)水洗,0.1%的鹽酸乙醇分化1min,水洗充分后溫水返藍(lán),流水沖洗,42℃溫箱烘干24h,中性樹膠封固。

    2.4光密度測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    在Olympus BX61型顯微鏡下觀察拍照,采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行光密度分析,測(cè)出切片中PAS陽(yáng)性部位的累積光密度(integrated optical density,IOD)和面積,算出平均光密度(mean optical density,MOD)。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性比較,P<0.05為差異顯著。

    結(jié) 果

    PAS染色后糖原顆粒呈紅色或紫紅色,石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)較為清晰,但肝細(xì)胞內(nèi)有較多空泡,糖原流失較多,且偏向了細(xì)胞的一側(cè)(圖1),冰凍切片肝細(xì)胞形態(tài)保持完好,糖原顆粒明顯比石蠟切片中大,且糖原保持較好的原位狀態(tài)(圖2)。光密度分析顯示冰凍切片糖原含量顯著高于石蠟切片(P<0.05)(表1),與冰凍切片相比,石蠟切片中糖原流失了28%左右。

    圖1 石蠟切片檢測(cè)牛蛙肝糖原,糖原呈紅色,PAS染色,標(biāo)尺:50μm圖2 冰凍切片檢測(cè)牛蛙肝糖原,糖原呈紅色,PAS染色,標(biāo)尺:50μmFig.1The liver glycogen of bullfrog detected with paraffin section,the glycogen appears red,PAS staining,scale bar:50μmFig.2The liver glycogen of bullfrog detected with frozen section,the glycogen appears red,PAS staining,Scale bar:50μm

    表1 石蠟和冰凍切片檢測(cè)牛蛙肝糖原含量Table 1 The content of glycogen in the liver of bullfrog detected with paraffin and frozen section

    討 論

    1.取材與固定

    制作石蠟切片時(shí),不同的固定方法對(duì)肝糖原的顯示影響較大,采用Carnoy固定液固定可較好地保存糖原,此外,低溫4℃下固定也可防止糖原丟失[2];冰凍切片無(wú)需對(duì)材料進(jìn)行固定處理,直接取材冷凍包埋后切片即可。

    2.切片與展片

    王玨等認(rèn)為肝臟的石蠟切片厚度一般在3μm為宜,組織太厚或太薄均不利于觀察[3]。制作3μm冰凍切片材料極易破碎,本實(shí)驗(yàn)冰凍切片厚度為5 μm,染色后效果亦較為理想。有報(bào)道認(rèn)為在70%酒精中展片可防止糖原流失染色效果較好,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在70%酒精中和清水中展片染色效果無(wú)明顯差異,可能是由于材料經(jīng)石蠟包埋,短時(shí)間水中展片不會(huì)導(dǎo)致糖原的流失。

    3.試劑配制

    實(shí)驗(yàn)采用無(wú)色品紅染色,本試劑因配制需活性炭吸附過(guò)濾,配制耗時(shí)較長(zhǎng),可適量多配制一些后在4℃冰箱避光保存。另外,本實(shí)驗(yàn)在配制無(wú)色品紅時(shí)發(fā)現(xiàn)若未經(jīng)活性炭吸附時(shí)溶液已基本無(wú)色,則該試劑與經(jīng)活性炭吸附后的試劑染色效果相同。有研究認(rèn)為,對(duì)于失效無(wú)色品紅溶液,在約每100ml試劑中加入0.5g偏重亞硫酸鈉,可恢復(fù)其染色能力[4],其他試劑均可現(xiàn)配現(xiàn)用。

    4.對(duì)照實(shí)驗(yàn)

    可用0.1%淀粉酶與37℃保溫箱中反應(yīng)1h左右,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將唾液稀釋6-9倍于雙層紗布過(guò)濾兩次后在37℃保溫箱中反應(yīng)30min左右,效果亦較為理想。不過(guò),反應(yīng)時(shí)間應(yīng)把握較為準(zhǔn)確,時(shí)間太短糖原未分解徹底,時(shí)間太長(zhǎng)又易致其它組織結(jié)構(gòu)分解,且染色沖洗時(shí)易掉片。實(shí)驗(yàn)組兩種切片經(jīng)高碘酸氧化后均不易掉片,但對(duì)照組由于經(jīng)過(guò)酶消化易掉片,沖洗時(shí)應(yīng)小心,對(duì)照組染色后PAS陰性,證明實(shí)驗(yàn)組PAS陽(yáng)性物質(zhì)為糖原。

    5.染色結(jié)果

    石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)雖然較為清晰,但肝細(xì)胞內(nèi)有較多空泡,可能是由于制片脫水過(guò)程中糖原溶解流失形成的。糖原偏向了細(xì)胞的一側(cè),有報(bào)道認(rèn)為這是由于固定劑把細(xì)胞內(nèi)的糖原推向固定劑對(duì)組織浸透的方向而造成[2];冰凍切片為切片后直接染色,因此可很好地保留糖原及其在細(xì)胞中的位置。

    總之,石蠟和冰凍兩種切片方式均可用于糖原染色,由于糖原易溶于水,兩種切片材料未經(jīng)高碘酸氧化前均不宜與水接觸,但制作石蠟切片時(shí)脫水脫蠟過(guò)程中不可避免要與水接觸,必然會(huì)造成不同程度的糖原流失,而冰凍切片可直接切片染色,無(wú)需與水接觸,不會(huì)造成糖原流失;石蠟切片制作實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較多,耗時(shí)較長(zhǎng),通常要48-72h,而冰凍切片制作實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較少、耗時(shí)短,只需5-6h。但冰凍切片需要冰凍切片機(jī),價(jià)格較昂貴,沒(méi)有石蠟切片機(jī)那么普及。本研究結(jié)果顯示,在條件許可的情況下,臨床病理診斷和生產(chǎn)實(shí)踐中檢測(cè)糖原含量變化時(shí),應(yīng)選用制作方便、耗時(shí)短且糖原不易流失的冰凍切片。

    [1]付銀鋒.PAS染色方法及應(yīng)用.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,26(2):100-101

    [2]尹洪萍,袁紅.不同固定方法對(duì)肝糖原顯示的影響.杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,4(6):479-480

    [3]王玨,王莉,張?。煌M織中PAS染色的特點(diǎn).鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,(5):505

    [4]方慶全,葉美華,黃紅浪.提高病理高碘酸雪夫氏法染色效果的體會(huì).臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,8(12):125-126

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