豬附紅細(xì)胞體的形態(tài)學(xué)觀察方法的比較

竇寧

豬附紅細(xì)胞體的形態(tài)學(xué)觀察方法的比較

竇寧

（山東省濟寧市畜牧獸醫(yī)局 272000）

本文通過鮮血壓片鏡檢、瑞氏染色、姬姆薩氏染色對豬附紅細(xì)胞體進行形態(tài)學(xué)方面的觀察，并對三種形態(tài)學(xué)研究方法的優(yōu)缺點進行評價。結(jié)果表明，鮮血壓片鏡檢法易受溫度影響，姬姆薩染色易受pH值和染色時間的影響，瑞氏染色法要防止顆粒沉積。

豬 附紅細(xì)胞體 形態(tài)學(xué)

附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonsis)是由附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓等部位引起的一種人畜共患病。在國外，曾報道過豬的附紅細(xì)胞體(Uilenberg，1981)。我國許耀臣(1992)年首次報道的豬的紅皮病就是豬的附紅細(xì)胞體病(E.suis)，至今已報道有豬、牛、羊、貓、鼠等動物及人的附紅細(xì)胞體病。張志明等(1996)在哲里木盟地區(qū)首次見到了牛附紅細(xì)胞體病。李秀敏等(1997)在北京首次發(fā)現(xiàn)了豬的附紅細(xì)胞體病。王學(xué)玲等(2000)在天津地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了豬附紅細(xì)胞體病。王紅梅(2002)在廊坊首次發(fā)現(xiàn)了豬附紅細(xì)胞體病。扶慶等(2001)在信陽首次報道了豬附紅細(xì)胞體病?，F(xiàn)在附紅細(xì)胞體病已經(jīng)廣泛分布于世界各地，并已在人、多種家畜、家禽和野生動物中發(fā)現(xiàn)。本文通過鮮血壓片鏡檢、瑞氏染色、姬姆薩氏染色等方法對豬附紅細(xì)胞體進行形態(tài)學(xué)觀察，以期為該病臨床診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬附紅細(xì)胞體病待檢血液 采集自然發(fā)病的附紅細(xì)胞體患豬的靜脈血，并用健康豬的靜脈血做陰性對照。

1.2 鮮血壓片鏡檢 將一滴靜脈血滴于載玻片上，加等量的生理鹽水稀釋，降低血漿粘度，防止血液中紅細(xì)胞重疊密集，以便觀察。在顯微鏡下找到紅細(xì)胞后，待血液停止流動后，即可觀察。

1.3 冰箱保存后觀察 將血液存放于4℃冰箱中，保存72h，進行觀察。

1.4 革蘭氏碘液處理附紅細(xì)胞體 以不同劑量和方法，應(yīng)用革蘭氏碘液處理附紅細(xì)胞體，觀察其變化情況。

1.5 姬姆薩氏染色 （1）姬姆薩氏染色液的配制：取姬姆薩染料0.6g，加入50ml甘油內(nèi)，于56℃下加熱2h，然后加入甲醇50ml，于3~5d后過濾，即為原液。使用時與不同pH的PBS液以1:20的比例混合，即為染色液[1]。（2）染色方法：無菌采取豬靜脈血，與染氏液1:1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片浸于不同pH的染色缸中，每種pH值放4張，并分別于6、12、18、24h后進行觀察。

1.6 瑞氏染色 推片自然干燥后，滴加按常規(guī)方法配制的瑞氏染色液，染色3min，然后加等量蒸餾水再染5min，蒸餾水沖洗。

2 結(jié)果

2.1 鮮血壓片鏡檢 光鏡下，附紅細(xì)胞體多為環(huán)形、球形、短桿形或星狀的閃光小體，附著于紅細(xì)胞表面單個或成團寄生，呈鏈狀或鱗片狀。嚴(yán)重感染病例的每個紅細(xì)胞上附紅細(xì)胞體可達(dá)20個以上，此時紅細(xì)胞在光鏡下猶如突起的蓖麻球和菠蘿狀。附紅細(xì)胞體在血漿中呈游離狀，常做擺動、扭轉(zhuǎn)、翻滾、上升、下降等運動，一旦附著在紅細(xì)胞上以后則停止運動，運動中以個體小者顯得最活潑。

2.2 保存后的觀察 將血液存放于4℃冰箱中，72h內(nèi)，血漿中的附紅體及菠蘿狀的紅細(xì)胞增多，經(jīng)56℃水浴1min恢復(fù)至雙凹狀，血液中游離的附紅體大量增加，運動活潑，有的跳躍，有的高速旋轉(zhuǎn)。如溫度增至60℃時大部分附紅體停止運動，100℃時，1min全部停止。

將含有菠蘿狀紅細(xì)胞的血液在4℃冰箱中存放72h后取出，生理鹽水洗滌3次，56℃水浴1min，將此液500rpm/ min離心取上清液，再3000rpm/min離心30min，棄上清取沉渣，見大量活動附紅體。

2.3 附紅細(xì)胞體對革蘭氏碘液的反應(yīng) 當(dāng)迅速向血液中加入2倍量的革蘭氏碘液時，附紅細(xì)胞體緊緊地依附于紅細(xì)胞表面，不活動。若徐緩地加入血液半量的革蘭氏碘液，附紅細(xì)胞體離開紅細(xì)胞，在液體中做旋轉(zhuǎn)運動，紅細(xì)胞恢復(fù)常態(tài)。若圍繞著血滴加入等量的革蘭氏碘液攪勻，可見附紅細(xì)胞體或在紅細(xì)胞表面做纖毛擺動樣運動，增加革蘭氏碘液則運動會停止。

2.4 姬姆薩染色 （1）不同pH值染色液對染色效果的影響：在pH8.0以上的堿性環(huán)境中，姬姆薩染料對附紅細(xì)胞體的著色效果較好，附紅細(xì)胞體著色較深，并且比較清晰，而在pH8.0以下的環(huán)境中則著色不好。結(jié)果見附表。（2）染色時間對染色效果的影響：染色6或12h觀察，整個血片著色不好。18h以上，鏡下觀察附紅體著色深，輪廓分明。姬姆薩氏染色后在紅細(xì)胞表面上可見到0.5~ 1.5μm的藍(lán)紫顆粒，呈圓形、逗號狀，每個紅細(xì)胞上可出現(xiàn)多個。正常的紅細(xì)胞形態(tài)完整，無小體附著。

附表 不同pH值染色液染色效果

pH值5.57.48.09.010.0 紅細(xì)胞顏色紅色紅稍深紅稍深紅深淺藍(lán)灰 附紅細(xì)胞體顏色及清晰度紅色，不清晰紫紅色，不清晰紫紅色，清晰紫紅色，清晰藍(lán)紫色，清晰

2.5 瑞氏染色 瑞氏染色后，紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體均為深藍(lán)紫色，附紅細(xì)胞體著色較深。在星形紅細(xì)胞的突出部位或紅細(xì)胞表面，可見到圓形深染的顆粒狀物，每個紅細(xì)胞上有3~8個不等。正常的紅細(xì)胞形態(tài)完整，沒有小體附著。

3 討論

（1）鮮血壓片鏡檢可以檢出附紅細(xì)胞體，但受溫度的影響。不同濃度的革蘭氏碘液也可使附紅體有不同的反應(yīng)。（2）姬姆薩氏染色的優(yōu)缺點：優(yōu)點是著色效果較好，缺點是染色所需時間較長。另外需要注意pH的影響，pH值偏堿有利于附紅體的著色。試驗表明，附紅細(xì)胞體的顏色與染液的pH值有密切關(guān)系，pH值愈高則染色愈深，這是因為姬姆薩氏染液由天青及伊紅組成，天青游離時帶正電荷，伊紅游離時帶負(fù)電荷，被染物的主要成分為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)本身帶兩種電荷，當(dāng)在堿性液體中時增加，天青離子附著得多些，附紅細(xì)胞體則較藍(lán)。在稀釋姬姆薩氏原液時如果使用蒸餾水(通常偏酸)，不利于區(qū)別紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體，這可能是其他作者看不到附紅細(xì)胞體一個原因。染色時間對附紅細(xì)胞體的著色也很重要，實驗表明：浸染18h以上才能獲得滿意的效果。（3）瑞氏染色的優(yōu)缺點：優(yōu)點是簡單快速，但是瑞氏染液中常常出現(xiàn)一些顆粒影響觀察。配制染料時要研磨仔細(xì)，先倒入少量染料、少量甲醇及甲醇后繼續(xù)研磨，如此反復(fù)數(shù)次。配制好后要多次過濾，使用時盡量使用中間層，以防顆粒沉積于血涂片上，影響觀察效果。染色后如果標(biāo)本片上附有較多顆粒，可滴加少量染液，稍后沖洗即可除去。

4 結(jié)論

鮮血壓片、姬姆薩氏染色、瑞氏染色均可檢出附紅細(xì)胞體，但在應(yīng)用時要注意：鮮血壓片鏡檢方法受溫度影響；姬姆薩氏染色受pH值和染色時間的影響，在pH8.0以上環(huán)境浸染18h以上染色效果好；瑞氏染色法要注意防止顆粒沉積，可以用滴加少量染液再沖洗的辦法去除顆粒。

[1] Uilenberg G，Zeeuwen AA，de Ruijter T. Eperythrozoon parvum (Rickettsias)in swine in the Netherlands.Tijdschr Diergeneeskd. 1981, 106: 456.

[2] 張志明, 丁國臣, 于廣忠. 哲里木盟地區(qū)首次見到牛附紅細(xì)胞體病[J]. 中國獸醫(yī)雜志. 1996, 23(10): 32.

[3] 李秀敏, 董煥程, 李富國. 北京市豬附紅細(xì)胞體病的發(fā)現(xiàn)和診斷[J]. 當(dāng)代畜牧, 1997(5): 20-21.

[4] 王學(xué)玲, 趙林, 沈津陽等. 天津地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)豬附紅細(xì)胞體病的診治[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2000, 7(3): 39-41.

[5] 王紅梅. 廊坊發(fā)現(xiàn)豬附紅細(xì)胞體病[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2002, 10(2): 23-25.

[6] 扶慶, 易本馳, 張汀. 信陽首次暴發(fā)豬附紅體病[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 2001, 22(12): 23.

[7] 曹澎輝. 獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 1991.

（2014–01–27）

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