siRNA 沉默PACE4 基因?qū)θ橄侔㎝CF-7 細(xì)胞生物學(xué)行為的作用

王菲菲 王 林 潘繼紅

乳腺癌發(fā)生率自20 世紀(jì)70 年代末開始一直呈上升趨勢。在我國，近年來由于人們生活方式、生活環(huán)境的改變，乳腺癌發(fā)生率的增長速度也迅速上升。迄今為止，乳腺癌的病因還未完全清楚，但是發(fā)病具有一定的規(guī)律性，其中許多研究表明，乳腺癌的發(fā)生與某些特定的基因密不可分［1，2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白原轉(zhuǎn)化酶家族與癌癥的關(guān)系密切，其中furin 和PACE4 尤為重要，二者在腫瘤的增殖、遷移等過程中均發(fā)揮著重要的作用［3］。Cheng 等［4］已經(jīng)證實(shí)，與正常組織相比，PACE4 在乳腺癌中呈過表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)借助RNA 干擾技術(shù)，以化學(xué)合成的siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染人的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞，通過qRT-PCR 以及Western blot 檢測基因沉默效率，篩選出特異性的siRNA，采用體外培養(yǎng)的方法觀察其對MCF -7 細(xì)胞的增殖能力和遷移能力以及細(xì)胞周期的影響。

材料與方法

1.試劑與材料:HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN，德國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，兔抗人多克隆抗體ab39877(Abcom，美國)，RNA 提取試劑盒(OMEGA，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)，實(shí)時熒光定量PCR 試劑(Roche，德國)，3 -(4，5 -二甲基噻唑-2)-2 -二苯基四氮唑溴鹽、DMSO 均購自索萊寶公司，siRNA 和PACE4引物由上海吉瑪設(shè)計(jì)合成，人乳腺癌MCF -7 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

2.細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染:細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 中，正常培養(yǎng)至80%融合時，加入胰酶消化，以3.0 ×105接種于24 孔板，按照HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，在24h 和36h 收集細(xì)胞。細(xì)胞分組:①siRNA-1 oligo干擾(1 -siPACE4)組;②siRNA -2 oligo 干擾(2 -siPACE4)組;③NC 組(陰性對照組);④MOCK 組(轉(zhuǎn)染試劑對照組)。

3.實(shí)時熒光定量PCR:采用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Human GAPDH 作為內(nèi)參，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，反應(yīng)40 個循環(huán)。以CT 法比較表達(dá)含量的表達(dá)變化。同時，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)一步驗(yàn)證定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。其中PACE4 引物設(shè)計(jì):5' - AAGCAAGGGAAGTTGAAAGA-3'(上游引物)，5' - CACTGAAGGTGTGGTACG-3'(下游引物)，GAPDH 引物設(shè)計(jì):5' -CACCATCTTCCAGGAGC - 3' (上游引物)，5' - AGTGGACTCCACGACGTA-3'(下游引物)。

4.蛋白水平檢測:采用Western blot 方法檢測:取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取蛋白，利用Bradford 方法對蛋白定量，采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉洗脫1h，加入兔抗人-PACE4 多克隆抗體，4℃過夜，洗膜后，加入二抗37℃孵育1h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影、定影。

5.MTT 法檢測細(xì)胞增殖:細(xì)胞以3.0 ×104接種于96 孔板上，瞬時轉(zhuǎn)染，設(shè)置對照組，每組設(shè)置3 個重復(fù)孔，分別在轉(zhuǎn)染后24、36、48h 加入20μl MTT，避光培養(yǎng)4h 后吸出培養(yǎng)基MTT 混合物，加入150μl DMSO，室溫?fù)u床放置10min，酶標(biāo)儀上測定各孔A 值。

6.細(xì)胞遷移試驗(yàn):將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以8.0 ×104接種于24 孔板，細(xì)胞融合達(dá)到80%時，采用20μl 槍頭在孔中劃3 條平行線，用PBS 漂洗2 次去除劃下的懸浮細(xì)胞，瞬時轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)36h 后，倒置顯微鏡下分別觀察0h 和36h 時劃痕中細(xì)胞遷移情況。顯微鏡下任取5 個視野對進(jìn)入劃痕中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

7.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1.0 ×106接種于6 孔板，干擾過程同前。設(shè)置干擾組，陰性對照組和轉(zhuǎn)染試劑組。干擾24h 和36h 后按照周期試劑盒測定，使用BD 流式細(xì)胞儀，分析軟件，重復(fù)3 次試驗(yàn)。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.siRNA 基因沉默對PACE4 基因的影響:(1)mRNA 水平:通過熒光定量PCR 對PACE4 的表達(dá)進(jìn)行檢測，與對照組相比，PACE4 基因的2 -siRNA 的mRNA 在36h 抑制效果最明顯(圖1，P ＜0.01)。將36h 的qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠，結(jié)果如圖2，與上述結(jié)果一致。(2)蛋白水平:通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PACE4 蛋白在MCF -7 細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在36h 時2 -siRNA 蛋白水平與對照組相比表達(dá)明顯降低，抑制效果最明顯，如圖3、圖4，此結(jié)果也與實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果一致。

圖1 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞PACE4 mRNA 在24h 及36h 的相對表達(dá)水平

圖2 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證siRNA 轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7 細(xì)胞36h 時的PCR 結(jié)果

圖3 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞24h 蛋白表達(dá)量

圖4 siRNA 轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞36h 蛋白表達(dá)量

2.MTT 法檢測siRNA 對乳腺癌MCF -7 細(xì)胞增殖能力的影響:結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染24、36和48h后，細(xì)胞的增殖速度與對照組相比明顯降低，且差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5，P ＜0.05)，結(jié)果也表明2 -siRNA在36h 的抑制效果最明顯。故挑選2 -siRNA 繼續(xù)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖5 MTT 方法檢測siRNA 沉默PACE4 的表達(dá)對乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

3.PACE4 siRNA 對MCF -7 細(xì)胞遷移能力的影響:采用細(xì)胞劃痕的方法對細(xì)胞遷移能力進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染36h 后，與0h 相比，沉默組細(xì)胞進(jìn)入劃痕的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，任取5 個視野對進(jìn)入劃痕的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組間差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6、圖7，P ＜0.05)。

4.PACE4 siRNA 對MCF-7 細(xì)胞周期的影響:利用流式細(xì)胞儀測定沉默PACE4 后對MCF -7 的作用，結(jié)果表明在24h 和36h，PACE4 的沉默對細(xì)胞周期的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖8 中A、B 所示。

圖6 細(xì)胞劃痕檢測siRNA 沉默PACE4 對乳腺癌MCF-7 細(xì)胞遷移能力的影響

討 論

乳腺癌的發(fā)生率已經(jīng)位居女性惡性腫瘤的首位。隨著篩查工作以及綜合治療的開展，乳腺癌已經(jīng)成為療效最佳的實(shí)體腫瘤之一，但是其病因的不確定性，使得對于乳腺癌的預(yù)防和治療仍需要得到人們的重視。目前對于乳腺癌的治療主要是放療、化療以及手術(shù)的方法，但是對于病患造成的傷害也是巨大的。隨著基因治療的不斷發(fā)展，分子靶向治療有望對于乳腺癌的治療提供新的希望。目前，在腫瘤的研究中，RNA 干擾技術(shù)已經(jīng)作為一種高度特異性沉默基因的方法被廣泛使用［5，6］。它的使用對腫瘤的基因研究，特別是作為對基因功能和基因治療等方面，以及體外實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了新的途徑。

圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)36h 進(jìn)入劃痕中的細(xì)胞

圖8 流式細(xì)胞儀測定siRNA 沉默PACE4 對MCF-7 細(xì)胞周期的影響

PACE4 是一種Ca2+依賴的枯草桿菌樣內(nèi)切蛋白酶，具有裂解偶合基本氨基酸序列的活性，其主要通過激活多種神經(jīng)肽類激素、生長因子、金屬蛋白酶類、膜結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等來發(fā)揮其作用［7～10］。對腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等起著重要作用。PACE4 在不同類型的腫瘤中表達(dá)特點(diǎn)不同，Bassi 等［11］發(fā)現(xiàn)PACE4 在皮膚癌中呈現(xiàn)過表達(dá)，此后他們還證明了利用PACE4 抑制劑可以明顯降低癌細(xì)胞的增殖率和遷移率［12］。另外D'Anjou 等［13］發(fā)現(xiàn)在蛋白原轉(zhuǎn)化酶家族中，只有PACE4 在前列腺癌中過表達(dá)。然而PACE4 在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中都呈低表達(dá)［14～16］。

近年來隨著新的致病基因被不斷的發(fā)現(xiàn)和提出，人們對于乳腺癌易感基因的研究也進(jìn)入了一個新階段［17］。本研究中利用siRNA 技術(shù)，合成靶向PACE4基因的siRNA，成功轉(zhuǎn)染MCF -7 細(xì)胞。特異性沉默PACE4 的表達(dá)，研究其對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移以及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明PACE4 基因的沉默，可以有效地降低細(xì)胞的增殖和遷移能力，沉默組與對照組相比差距都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。后續(xù)筆者在不同的時間采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，PACE4 的沉默對于細(xì)胞周期的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因?yàn)榧?xì)胞是一個具有復(fù)雜功能的個體，其周期的影響涉及很多因素。

本研究初步表明，PACE4 在乳腺癌的增殖和遷移中起到了重要的作用，下調(diào)其表達(dá)可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。近來我們實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片的方法對PACE4 的下游基因進(jìn)行了一系列的篩查，正在努力找出在乳腺癌中與增殖和遷移相關(guān)的下游基因，對PACE4 的作用機(jī)制進(jìn)一步探索。相信PACE4 有望作為乳腺癌基因治療的一個新的靶點(diǎn)，為新藥的開發(fā)提供一個新的依據(jù)。

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