菊芋提取液的皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂試驗(yàn)研究

汪倫記 糾 敏 吉艷青 尤曉顏

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1, 洛陽(yáng) 471023)(洛陽(yáng)市第四職業(yè)高中2, 洛陽(yáng) 471000)

生物柴油(Biodiesel)是指以植物油脂、動(dòng)物油脂和廢餐飲油等為原料，通過(guò)酯交換工藝制成的甲酯或乙酯燃料。作為可替代石化柴油的清潔生物燃料，生物柴油的生產(chǎn)成本和使用性能都與現(xiàn)用石化柴油基本相當(dāng)，且具有良好的環(huán)境特性和可生物降解性，具有廣闊的發(fā)展前景[1-2]。在生物柴油的生產(chǎn)中，原料成本占生產(chǎn)成本的75%以上，是制約生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。美國(guó)主要采用豆油，歐洲采用菜籽油，印度尼西亞和日本分別采用棕櫚油和廢油生產(chǎn)生物柴油[3]。我國(guó)人口眾多，耕地資源匱乏，若直接利用菜籽油或豆油等食用油脂生產(chǎn)生物柴油，由于原料和經(jīng)濟(jì)原因，不具備經(jīng)濟(jì)性。

微生物油脂發(fā)酵技術(shù)是生物柴油生產(chǎn)的一個(gè)研究發(fā)展方向。微生物油脂的脂肪酸組成與植物油相近，以C16和C18系脂肪酸為主[4]。微生物發(fā)酵產(chǎn)油具有發(fā)酵周期短，可連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)；而且產(chǎn)油微生物菌種資源豐富，能利用和轉(zhuǎn)化各種農(nóng)林廢棄木質(zhì)纖維素原料，對(duì)中國(guó)這樣一個(gè)農(nóng)業(yè)占較大比重的國(guó)家具有特殊意義。

目前，對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)油微生物碳源的研究主要集中在葡萄糖基原料、淀粉質(zhì)原料和纖維素原料。但采用這3種原料作為生物柴油生產(chǎn)的碳源，原料成本仍然是制約生物柴油產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素。因此，一種果糖基新型能源植物——菊芋，正日益受到關(guān)注。菊芋是一種多年生的草本植物，其塊莖富含菊糖，占其干重的68%～83%。菊糖是由D-呋喃果糖經(jīng)β-2,1-糖苷鍵聚合而成的一種果聚糖，呈直鏈結(jié)構(gòu)，末端含有一個(gè)葡萄糖基[5]。與淀粉和纖維素相比，菊糖更易被水解成果糖和葡萄糖[6]，而且，菊芋具有適應(yīng)性強(qiáng)，耐貧瘠，耐寒，耐旱等特點(diǎn)，特別適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非農(nóng)業(yè)耕地種植，且產(chǎn)量高，價(jià)格低廉?；谝陨线@些優(yōu)點(diǎn)，菊芋已成為生產(chǎn)燃料乙醇、乳酸、琥珀酸、丁醇等生物質(zhì)能源、食品和化工原料可供選擇的廉價(jià)碳源之一[7-11]。目前對(duì)以菊芋為原料生產(chǎn)生物柴油報(bào)道不多，因此本試驗(yàn)對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖提取液生產(chǎn)油脂進(jìn)行了研究，為以菊芋為原料制備生物柴油奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菊芋粉：鮮菊芋塊莖購(gòu)自洛陽(yáng)，經(jīng)切片、曬干、粉碎(100 目)，4 ℃冷藏備用。蛋白胨、酵母膏、蔗糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、瓊脂粉、氯仿、甲醇等試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌種

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.3 菌種培養(yǎng)

1.3.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：新鮮黃豆芽100，蔗糖50，瓊脂30。配制后121 ℃滅菌20 min備用。種子培養(yǎng)基(g/L)：新鮮黃豆芽100，蔗糖50。配制后121 ℃滅菌20 min備用。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：挑取1～2 環(huán)皮狀絲孢酵母接種于斜面培養(yǎng)基，置入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，斜面放入4 ℃保藏備用。

種子培養(yǎng)：挑取斜面上菌種 2～3 環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床中，30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。

1.4 菊糖提取試驗(yàn)

稱取定量的菊芋粉溶于蒸餾水中，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間處理后，4 000 r/min離心10 min除去沉淀，取上清液，測(cè)定總糖和還原糖含量，計(jì)算菊糖得率。除特別指明外，初始菊芋粉濃度為60 g/L，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間80 min。

1.5 皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂試驗(yàn)

先對(duì)制備好的菊糖提取液進(jìn)行酶解。酶解條件：菊糖外切酶添加量為20 U/g菊糖，55 ℃保溫8 h。酶解后酶解液115 ℃滅菌30 min備用。

將培養(yǎng)好的皮狀絲孢酵母接入菊糖提取液中，除特別提出外，初始接種量為8%，初始pH值為5.0，初始培養(yǎng)溫度為30 ℃，150 r/min，恒溫培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液4 000 r/min離心15 min，棄上清，取沉淀進(jìn)行油脂提取。

1.6 生物量的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取一定量的發(fā)酵液于離心管中，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，得到濕菌體，將濕菌體于105 ℃干燥箱中烘至恒重，菌體的生物量以g(干菌)/L發(fā)酵液表示[12]。

1.7 油脂提取

酸熱提取法[13]。出油率根據(jù)下面的公式計(jì)算。

1.8 菊糖與發(fā)酵液中總糖和殘?zhí)呛康臏y(cè)定

菊糖含量測(cè)定：采用總糖含量減去還原糖含量的方法。

總糖和還原糖測(cè)定：DNS比色法?？偺菧y(cè)定以還原糖計(jì)，定量待測(cè)樣品于0.05 mol/L HCl 中，沸水浴中回流水解1 h，用0.05 mol/L NaOH 調(diào)成中性[14]。

1.9 菊糖酶酶活測(cè)定

菊糖外切酶酶活測(cè)定[15]：0.5 mL酶液(若必要，適當(dāng)稀釋)加入到4.5 mL 2%的蔗糖溶液(0.2 mol/L pH 4.6醋酸緩沖液配制)，55 ℃反應(yīng)10 min，沸水滅活，DNS法測(cè)還原糖含量。酶活力定義為：以蔗糖為底物，每分鐘水解1 μmol蔗糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.10 菊芋粉組分分析

總氮含量：凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)[16]；粗纖維含量：《植物類食品中的粗纖維測(cè)定》(GB/T 5009.10—2003)[17]；礦物質(zhì)元素含量：原子吸收光譜法；Mg2+、Fe3+、Mn2+測(cè)定：GB/T 5009.90— 2003[18]；K+、Na+測(cè)定：GB/T 5009.91—2003[19]；Ca2+測(cè)定：GB/T 5009.92—2003[20]；磷的測(cè)定：GB/T 5009.87—2003[21]；灰分：灼燒法[22]。

水分含量測(cè)定：取定量樣品放入105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，干燥前和干燥后質(zhì)量之差即為水量的質(zhì)量。

1.11 脂肪酸成分的測(cè)定

氣相色譜法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋粉的成分分析

菊芋粉中主要成分為菊糖，占其干重的73.36%，還原糖為3.12%，這兩部分總量大于76%，除此之外，還含有一定量的粗纖維、氮素和無(wú)機(jī)鹽成分(表1)。

表1 菊芋粉的組成成分

2.2 菊芋粉中菊糖浸提條件的優(yōu)化

菊芋是一種碳含量很高的能源植物，可以用作皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂的原料。但直接采用菊芋做原料進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂，則在離心收獲菌體時(shí)，粗纖維也一起沉淀下來(lái)，給后續(xù)的油脂提取帶來(lái)麻煩。因此，考察了浸提時(shí)間、溫度和菊芋粉濃度對(duì)菊糖提取率的影響。

2.2.1 浸提時(shí)間對(duì)菊糖提取率的影響

隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，菊糖的提取率也逐漸增大，當(dāng)浸提時(shí)間為80 min時(shí)，提取率達(dá)到了95%以上，但隨著浸提時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率提高不顯著(表2)。因此，綜合考慮提取率和經(jīng)濟(jì)性的因素，選擇浸提時(shí)間為80 min。

表2 提取時(shí)間對(duì)菊糖提取率的影響

2.2.2 浸提溫度對(duì)菊糖提取率的影響

隨著溫度的升高，菊糖的提取率也逐漸增大，當(dāng)浸提溫度達(dá)到85 ℃時(shí)，提取率達(dá)到了95%以上，隨著溫度繼續(xù)升高，提取率提高不顯著(表3)。因此，綜合考慮提取率和能耗的因素，選擇浸提溫度為85 ℃。

表3 溫度對(duì)菊糖提取率的影響

2.2.3 菊芋粉濃度對(duì)菊糖提取率的影響

由表4可知，菊芋粉濃度越低，菊糖的提取率越高，但菊芋粉濃度較低時(shí)，提取液中可發(fā)酵糖含量較低，影響皮狀絲孢酵母的生物量和油脂產(chǎn)量；濃度太高時(shí)，提取液可發(fā)酵糖含量提高，但提取率下降，而且過(guò)高的可發(fā)酵糖含量也影響皮狀絲孢酵母的生物量和油脂產(chǎn)量，因此，選擇菊芋粉濃度為70 g/L為最適提取濃度。在此濃度下，菊糖的提取率達(dá)95%以上。

表4 菊芋粉濃度對(duì)菊糖提取率的影響

2.3 皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的試驗(yàn)

2.3.1 pH對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

pH值是微生物生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)的一項(xiàng)重要的指標(biāo)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和油脂的積累的影響非常大。因此，選擇pH值4、4.5、5、5.5、6、6.5進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)初始pH值為5.5時(shí)，皮狀絲孢酵母的生物量、出油率和油脂得率達(dá)到最大，分別為14.04 g/L、35.17%和5.11 g/L。

2.3.2 接種量對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

接種量對(duì)菌體油脂的積累也有重要影響。當(dāng)接種量過(guò)少時(shí)，培養(yǎng)基中豐富的營(yíng)養(yǎng)使菌體大量繁殖，從而減少了油脂的積累，使出油率過(guò)低；當(dāng)接種量過(guò)多時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分將成為菌體生長(zhǎng)的限制因素，對(duì)微生物群體生長(zhǎng)和油脂積累產(chǎn)生不利的影響。因此，選擇2%、4%、6%、8%、10%和12%6種接種量進(jìn)行試驗(yàn)。由圖2可知，當(dāng)接種量為10%時(shí)，生物量、出油率和油脂得率達(dá)到最大，分別為14.11 g/L、35.19%和5.04 g/L。隨著接種量的增加，生物量和出油率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

圖1 不同初始pH對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖 提取液產(chǎn)油脂的影響

圖2 接種量對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖 提取液產(chǎn)油脂的影響

2.3.3 溫度對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

溫度對(duì)油脂的脂肪酸成分有直接的影響，脂肪酸的相對(duì)含量會(huì)隨發(fā)酵溫度的高低的變化而發(fā)生相應(yīng)的變化。因此，考察了不同溫度對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。28 ℃時(shí)，出油率最高，達(dá)35.41%，但當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，生物量最高，達(dá)14.08 g/L，而且培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，出油率也較高，為35.12%，綜合生物量和出油率兩方面因素，選擇30 ℃作為皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵的最適溫度。

2.3.4 氮素對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

氮素對(duì)酵母的生長(zhǎng)、繁殖和油脂積累有重要的影響。氮素能加快細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。因此，培養(yǎng)前期為獲得大量菌體，要求培養(yǎng)基碳氮比低，而培養(yǎng)后期為了積累更多油脂，要求培養(yǎng)基的碳氮比高。

菊芋中的氮素多以蛋白和氨基酸的形式存在，不含無(wú)機(jī)氮，且總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有5.69%。因此，考察了補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮對(duì)皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響。在產(chǎn)脂培養(yǎng)基中分別添加無(wú)機(jī)氮源硝酸銨、硝酸鉀、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素；有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨作為補(bǔ)充氮源，添加量為2 g/L，進(jìn)行皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 溫度對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

圖4 氮源對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂的影響

由圖4可知，補(bǔ)充添加有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源對(duì)皮狀絲孢酵母生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但生物量增加不顯著；補(bǔ)充添加有機(jī)氮源能較顯著提高生物量，但出油率偏低。究其原因是由于豐富的有機(jī)氮源促進(jìn)細(xì)胞的大量增殖，而導(dǎo)致油脂積累少。這表明，菊芋中含有氮素能滿足酵母的生長(zhǎng)需求，補(bǔ)充添加氮素不能顯著提高油脂得率。

2.4 皮狀絲孢酵母分批發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂放大試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖提取物產(chǎn)油脂分批放大進(jìn)行研究。5 L發(fā)酵罐裝液量為2.7 L，發(fā)酵液總糖含量為54 g/L，初始pH值5.5，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃，定期取樣測(cè)其總糖含量、生物量和油脂得率，結(jié)果見(jiàn)圖5。在5 L發(fā)酵罐中，皮狀絲孢酵母分批發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂能達(dá)到較高的生物量和油脂得率，72 h，發(fā)酵結(jié)束后，生物量和油脂得率分別達(dá)到13.93 g/L和4.89 g/L，出油率為34.73%。

圖5 5L發(fā)酵罐皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖提取液產(chǎn)油脂

2.5 皮狀絲孢酵母的脂肪酸組分分析

皮狀絲孢酵母菌油脂脂肪酸組分分析結(jié)果見(jiàn)表5。皮狀絲孢酵母所產(chǎn)生的脂肪酸主要是C16和C18系列脂肪酸，含6種成分。其中以油酸為主，其次為棕櫚酸和亞油酸，棕櫚油酸、硬脂酸和亞麻酸含量較低。其中80.2%以上是C16∶0、C18∶1 和C18∶2，尤其是C18∶1(43.0%)。皮狀絲孢酵母菌的脂肪酸組分分析結(jié)果表明，其油酸、棕櫚酸和亞油酸占總脂肪酸組成上和植物油脂非常接近。因此，皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖生產(chǎn)的油脂可作制備生物柴油的替代原料。

表5 皮狀絲孢酵母脂肪酸組分及含量

3 結(jié)論

對(duì)菊芋粉的成分分析表明：菊芋中的碳主要以菊糖的形式存在，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)73.36%，還原糖和粗纖維的含量非常低，只有3.12%和5.55%，除此之外，還含有少量的氮和微量的鉀、鈉、磷、鈣、鎂、鐵和錳等無(wú)機(jī)鹽。與淀粉質(zhì)原料相比，菊糖更易于被降解成單糖，因此，菊芋作為果糖基的能源植物，日益受到廣泛關(guān)注。

菊糖的最優(yōu)浸提條件為：菊芋粉質(zhì)量濃度為70 g/L、提取溫度為85 ℃、提取時(shí)間為80 min。在此優(yōu)化條件下，菊糖提取率可達(dá)95%以上。

皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊糖的最佳培養(yǎng)條件為：初始pH值5.5、接種量10%、培養(yǎng)溫度30 ℃。在此優(yōu)化條件下，5 L發(fā)酵罐分批擴(kuò)大培養(yǎng)，其生物量、出油率和油脂得率分別達(dá)到13.93 g/L、34.73%和4.89 g/L。補(bǔ)充添加氮源對(duì)生物量、出油率和油脂得率的提高不顯著。

采用氣相色譜法對(duì)皮狀絲孢酵母油脂的脂肪酸成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其脂肪酸成分主要是C16和C18系列脂肪酸，其中80.2%以上是C16∶0、C18∶1和C18∶2，尤其是C18∶1(43%)，其油酸、棕櫚酸和亞油酸占總脂肪酸組成上和植物油脂非常接近。因此，皮狀絲孢酵母發(fā)酵生產(chǎn)的油脂可作制備生物柴油的替代原料。

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