玉米種子消毒條件的優(yōu)化及成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的研究

王洪振，陳 徐，黃二沖，程 軍，周曉馥，劉春明，金太成

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 四平 136000)

0 引言

玉米(ZeamaysL)是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，玉米的組織培養(yǎng)研究是玉米生物技術(shù)育種的基礎(chǔ)性工作，一直深受重視．相對于玉米幼胚，玉米成熟種子易于大量保存，不受生長季節(jié)和數(shù)量限制，可以隨時取用．因此，成熟玉米種子是一種較理想的適用于玉米組織培養(yǎng)的外植體．1974年，Green等首次報道玉米成熟胚組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，但是沒有獲得再生植株[1]．1987年，Wang等報道利用玉米成熟胚組織培養(yǎng)得到了再生植株[2]．此后，以成熟胚為外植體的玉米組織培養(yǎng)取得成功的報道越來越多[3-9]．

玉米種子消毒是成熟胚組織培養(yǎng)的第一步，對玉米成熟胚組織培養(yǎng)的成功有重要影響．現(xiàn)有的報道中，大部分實驗中使用0.1%升汞(HgCl2)作為消毒劑[10-24]，也有使用0.2%升汞的報道[25]．趙錦慧等研究了0.1%升汞消毒時間對成熟胚污染率的影響，結(jié)果表明，消毒時間在5 min以上時,胚無污染現(xiàn)象,但8 min以上時,胚周圍均有發(fā)黑現(xiàn)象,消毒時間越長,發(fā)黑癥狀越嚴(yán)重．因此,綜合污染情況以及誘導(dǎo)與繼代情況,確定最適合的消毒時間為5～7 min[15]．由于升汞(氯化汞)是一種劇毒試劑，消毒原理是Hg2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，從而殺死菌體．升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留．消過毒的外植體材料要用無菌水反復(fù)多次洗滌以將藥劑除凈．氯化汞也會給環(huán)境造成較大污染，應(yīng)盡量減少或不用氯化汞為宜[26]．

次氯酸鈉也是一種植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體．其消毒能力很強(qiáng)，而且消毒后氯氣很容易揮發(fā)而不會因為消毒劑殘留而對材料造成傷害，對環(huán)境無害．2011年，呂杰等報道使用10%次氯酸鈉消毒處理玉米種子進(jìn)行玉米成熟胚組織培養(yǎng)的研究[27]．當(dāng)前使用次氯酸鈉進(jìn)行玉米種子消毒的報道較少，因此本文設(shè)計了2%次氯酸鈉溶液對三種玉米種子進(jìn)行不同時間的消毒處理，目的是優(yōu)化以次氯酸鈉為消毒劑的玉米種子消毒條件，以減少氯化汞的使用，為以成熟玉米種子為材料的實驗研究提供更加環(huán)保的消毒方法．

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗中所用玉米(Zeamays)種子為平育2B、神50、神56．

(2)試劑.無水乙醇、MS基本鹽等均為市售分析純試劑．次氯酸鈉溶液有效氯含量為10%，現(xiàn)用現(xiàn)配，用蒸餾水稀釋五倍即為本實驗所用2%次氯酸鈉溶液．

(3)儀器設(shè)備.ACCULAB ALC-110.4電子天平，德國Sartorious 集團(tuán)；YXQ-LS-50SⅡ立式蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DL-CJ-2ND 型超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PGX-450D型智能光照培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠.

1.2 方法

(1)玉米種子消毒及浸泡處理 挑選大小均勻飽滿的成熟玉米種子，用清水沖洗后用75%乙醇消毒1 min，2%次氯酸鈉溶液分別消毒4 min、6 min、8 min、10 min、12 min．然后放入無菌50 ml三角瓶中，每瓶10粒種子，加入無菌水，以剛能浸沒為準(zhǔn)． (2)玉米種子污染觀察 將消毒后的種子放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，溫度設(shè)為26 ℃．每天觀察種子生長情況，以種子長菌和無菌水變渾濁為污染標(biāo)準(zhǔn)，并分別于24 h、48 h、72 h和96 h進(jìn)行觀察．(3)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo) 以優(yōu)化后的消毒條件處理玉米種子神56，無菌水浸泡72 h后剝?nèi)〕墒炫撸嘏咻S縱切兩半，切口向下接種于MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25 ℃±1 ℃智能光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)三周后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率并進(jìn)行繼代培養(yǎng)．

愈傷組織誘導(dǎo)率=(出愈的胚數(shù)/接種的胚數(shù))×100%．

1.3 培養(yǎng)基

實驗中所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，除基本培養(yǎng)基不同外均添加:Glu(300 mg/L)+CH(500 mg/L)+Pro(700 mg/L)+KT(0.5 mg/L)+3%蔗糖+瓊脂(7.5 g/L)，pH 5.8.在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的2,4-D制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所用2,4-D濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，分別命名為k1、k2、k3、k4、k5培養(yǎng)基,常規(guī)高壓消毒．試驗中所用繼代培養(yǎng)基分別與所用誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同．

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米種子消毒條件的優(yōu)化

三種玉米種子平育2B、神50、神56，分別用2%次氯酸鈉溶液消毒4 min、6 min、8 min、10 min，12 min，結(jié)果如表1、表2和表3所示．“-”表示未污染，“+”表示已經(jīng)污染．

實驗結(jié)果表明，2%次氯酸鈉溶液處理玉米種子平玉2B 8 min以上，處理玉米種子神50 8 min以上，處理玉米種子神56 10 min以上均達(dá)到了較好的消毒效果．

2.2 神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代

不同2,4-D濃度對神56愈傷組織誘導(dǎo)率的影響見圖1．在五種成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基k1、k2、k3、k4、k5上，神56成熟胚均成功誘導(dǎo)出愈傷組織，在k3培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效果最佳．

表1 玉米種子平育2B 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

表2 玉米種子神56 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

表3 玉米種子神56 2%次氯酸鈉溶液消毒結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 玉米種子的消毒

玉米種子的消毒是實驗研究的第一步，對后續(xù)實驗的成功起著非常重要的作用．玉米種子的消毒不僅在玉米成熟胚培養(yǎng)中有重要應(yīng)用，而且在以玉米種子為基礎(chǔ)的萌動胚和以玉米幼苗不同部位為外植體的其他研究中也有廣泛的應(yīng)用，近年來這方面的報道也越來越多[28-30]．這些報道中進(jìn)行玉米種子消毒所用的消毒劑都是升汞(氯化汞)．氯化汞作為最為常用的消毒劑，殺菌能力最強(qiáng)，但它對外植體的傷害也最大，且不易去除，一般使用0.01%～1%低濃度[31]．如前所述，氯化汞也會給環(huán)境造成較大污染，應(yīng)盡量減少或不用氯化汞為宜[26]．次氯酸鈉殺菌力強(qiáng)，易去除，不留殘毒，是使用較多的殺菌劑之一[32]．因此本實驗優(yōu)化了以次氯酸鈉為消毒劑的玉米種消毒條件優(yōu)化研究．結(jié)果表明，使用2%次氯酸鈉溶液處理玉米種子10 min以上達(dá)到很好的消毒效果．

為了進(jìn)一步檢驗次氯酸鈉對玉米種子的消毒效果和實際應(yīng)用，實驗中選取神56玉米種子進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)研究．在五種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，均誘導(dǎo)出了愈傷組織，實驗結(jié)果(見圖1)表明本實驗的玉米種子消毒條件可以應(yīng)用于玉米成熟胚的組織培養(yǎng)研究中．

3.2 神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)

圖1 神56成熟胚不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

本實驗也研究了不同質(zhì)量濃度2,4-D對神56玉米種子成熟胚誘導(dǎo)的影響．實驗中設(shè)計了五種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所用2,4-D質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，分別命名為k1、k2、k3、k4、k5培養(yǎng)基．實驗結(jié)果(見圖1)表明在一定濃度范圍內(nèi)，玉米成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率隨著2,4-D的濃度增加而增大．當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L時，誘導(dǎo)率達(dá)到最大，濃度繼續(xù)增大時，誘導(dǎo)率反而下降．因此k3培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好,所用激素組合為2.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L KT．

本實驗的結(jié)果與賈秀萍、張立軍和季麗麗等的結(jié)果相似，而與項艷和裴冬麗等的結(jié)果略有不同．賈秀萍、張立軍和季麗麗等人的研究表明2,4-D濃度為2.0 mg/L時愈傷組織的誘導(dǎo)率最高[11,13,23]．項艷等的實驗結(jié)果表明自交系178在含有4.0 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)生了最高的愈傷組織誘導(dǎo)頻率[10]．裴冬麗等發(fā)現(xiàn)豫玉32在添加4.0 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高[20]．綜合分析導(dǎo)致所用2,4-D質(zhì)量濃度不同的原因，是由于進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)時不同的玉米品系對外源植物激素的需求不同所致．因此，不同的玉米品系進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)時，對外源植物激素開展優(yōu)化研究是非常有必要的．

總之，本研究以三種玉米種子平育2B、神50、神56為實驗材料，優(yōu)化了以次氯酸鈉為消毒劑的消毒條件，為當(dāng)前以升汞為主要消毒劑的研究提供了替代方法．本研究還優(yōu)化了神56成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)條件，這些結(jié)果必將在以玉米種子為材料的研究中發(fā)揮越來越重要的參考作用．

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