植物中RNA沉默機(jī)制的研究進(jìn)展

金太成,楊麗萍，勾 暢，許亞男，鄭 爽

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

基因沉默 (gene silencing) 現(xiàn)象最早是在1990年被發(fā)現(xiàn)的．Napoli等人為了加深矮牽牛花的顏色，在參與花青素合成過程中的關(guān)鍵酶—苯基乙烯酮合酶的基因前加上了一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，并轉(zhuǎn)入矮牽?；ㄖ校墙Y(jié)果與預(yù)期相反，花的顏色不但沒有變成深紫色，反而變淺或變成白色[1]．后來人們稱這種現(xiàn)象為共抑制 (cosuppression)．此后，在很多植物中都發(fā)現(xiàn)了共抑制現(xiàn)象，這就是我們現(xiàn)在所熟知的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象．大量研究表明基因沉默也存在于哺乳動(dòng)物中， Elbashir等實(shí)驗(yàn)說明了21個(gè)核苷酸的雙鏈dsRNA可以有效地誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因沉默[2]；Paddison等研究表明，小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA) 能夠有效地抑制小鼠體細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞中基因的表達(dá)[3]．越來越多的研究結(jié)果讓人們逐漸認(rèn)識(shí)到基因沉默是控制基因及其表達(dá)的有力工具，為研究人類基因功能和治療人類疾病提供了基礎(chǔ)依據(jù)．

1 植物RNA沉默

基因沉默 (gene silencing) 是指生物體中某個(gè)基因由于轉(zhuǎn)錄被抑制或翻譯被抑制等原因而不能正常表達(dá)的現(xiàn)象．基因沉默主要有三種類型，一是由于DNA甲基化導(dǎo)致基因不能被轉(zhuǎn)錄，從而抑制基因的表達(dá)，被稱為轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默 (transcriptional gene silencing，TGS)；二是由于轉(zhuǎn)錄后的RNA序列被剪切導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的現(xiàn)象，被稱為轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 (post-transcriptional gene silencing，PTGS)；三是由于基因所在位置不同而影響基因表達(dá)的現(xiàn)象，被稱為位置效應(yīng) (position effect)[4]．

1.1 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TGS)

基因及其啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的高度甲基化可以導(dǎo)致基因發(fā)生TGS．人們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TGS發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，siRNA在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用，通過DNA甲基化來阻斷基因的表達(dá)．植物能夠通過這種途徑防御外源DNA序列和DNA病毒的入侵．例如，當(dāng)DNA病毒侵染植物時(shí)，病毒的單鏈DNA序列在宿主特有的DNA依賴的RNA聚合酶(DNA-Dependent RNA polymerase)Pol IV 作用下，轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA，并在RNA依賴的RNA聚合酶 (RNA-Dependent RNA polymerase，RDR2)作用下合成雙鏈RNA，其在Ⅲ型RNA酶Dicer(Dicer-Like，DCL3)蛋白的剪切作用下形成24nt siRNA，24nt siRNA的一條鏈進(jìn)入ARGONAUTE4蛋白(AGO4)，并招募植物特有蛋白DNA依賴的RNA聚合酶Pol V，對(duì)其同源序列進(jìn)行DNA甲基化，此過程還要求甲基化轉(zhuǎn)移酶的參與[5-9]．這一過程是由RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA directed DNA Methylation，RdDM)[10]．RdDM途徑要求24-nucleotide (nt) siRNA對(duì)三種類型的甲基化位點(diǎn)包括CG、CNG和CHH位點(diǎn)進(jìn)行DNA甲基化的從頭合成．DNA甲基化最終導(dǎo)致基因不能發(fā)生轉(zhuǎn)錄而抑制基因的表達(dá)．

1.2 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)

植物中PTGS發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，同樣利用siRNA特異性的識(shí)別并靶向RNA序列進(jìn)行剪切或翻譯抑制．小分子RNA，例如microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)，在其中發(fā)揮著重要作用．參與這些小分子RNA形成的主要的宿主元件包括Ⅲ型RNA酶Dicer(Dicer-Like，DCL)和包含ARGONAUTE類蛋白(AGO)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，以及RNA依賴的RNA聚合酶RDR(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)等作用蛋白[5]．

具體過程：第一步是雙鏈RNA (dsRNA)的形成．dsRNA的形成是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默即PTGS過程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，外源DNA序列如轉(zhuǎn)基因序列的插入和外源RNA序列如RNA病毒等均可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生dsRNA．實(shí)驗(yàn)證明體外人工合成的序列互補(bǔ)的單鏈RNA或dsRNA導(dǎo)入體內(nèi)都可誘導(dǎo)PTGS的發(fā)生[11]．目前已知的植物病毒基因組90%以上都是單鏈RNA(ssRNA)，這種基因組依靠病毒自身編碼的RdRP蛋白合成dsRNA．此外，異常的單鏈RNA能夠先通過RdRP蛋白合成dsRNA，再誘導(dǎo)產(chǎn)生PTGS效應(yīng)．轉(zhuǎn)座子(transposon)也可以產(chǎn)生dsRNA[12]．其次是siRNA的形成．現(xiàn)已確認(rèn)Dicer蛋白是將長(zhǎng)鏈dsRNA降解為siRNA的作用蛋白．小分子RNA產(chǎn)生的基本過程是來源不同的dsRNA進(jìn)入Dicer中被剪切成21-24nt的雙鏈小分子RNA．最后是mRNA的降解．小分子RNA的一條鏈進(jìn)入包含AGO蛋白的RISC復(fù)合物，并引導(dǎo)RISC復(fù)合物結(jié)合到與小分子RNA單鏈相匹配的靶標(biāo)RNA鏈上，引起目的mRNA的剪切、降解、翻譯抑制或者是DNA和組蛋白的修飾[13-14]．

1.3 位置效應(yīng)

位置效應(yīng)是由于基因在基因組中的位置影響了基因的表達(dá)．如果外源基因整合到異染色質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域甲基化程度高、轉(zhuǎn)錄活性低，一般不能表達(dá)；如果外源基因整合到常染色質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域甲基化程度低、轉(zhuǎn)錄活性高，則有利于基因的表達(dá)．目前，外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法是將外源基因隨機(jī)整合在宿主的基因組中，因此，基因的插入位點(diǎn)、序列的甲基化程度高低和轉(zhuǎn)錄是否活躍就決定了外源基因能否穩(wěn)定的表達(dá)．外源基因插入位點(diǎn)形成宿主易于識(shí)別的甲基化位點(diǎn)，就會(huì)導(dǎo)致其在甲基化酶的作用下發(fā)生甲基化而失活．

2 RNA沉默的主要功能

RNA沉默能夠引起基因表達(dá)的阻斷，并參與抗病毒和環(huán)境脅迫反應(yīng)．2008年，Bisaro實(shí)驗(yàn)室使用CaLCuV和BCTV侵染一系列包括胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶、siRNA介導(dǎo)的甲基化途徑相關(guān)的突變體發(fā)現(xiàn)甲基化缺陷的一系列突變體以及ADK突變體對(duì)雙生病毒侵染的敏感性都增加了，癥狀更加明顯．同時(shí)，他們通過亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)了雙生病毒侵染的擬南芥，發(fā)現(xiàn)雙生病毒基因組DNA的一些潛在的甲基化位點(diǎn)確實(shí)被甲基化了，而L2突變的雙生病毒的甲基化程度，特別是非對(duì)稱型的CHH甲基化水平相應(yīng)的提高，并且該高度甲基化表型需要AGO4的參與[15]．最近，他們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，AL2和L2能夠抑制GFP轉(zhuǎn)基因的TGS，還能造成植物宿主基因組中高度重復(fù)序列甲基化程度降低，進(jìn)一步說明AL2和L2能夠通過抑制ADK的活性抑制植物宿主siRNA介導(dǎo)的甲基化途徑[16]． 植物通過siRNA介導(dǎo)的RdDM對(duì)轉(zhuǎn)座子，重復(fù)序列等內(nèi)源DNA序列進(jìn)行甲基化從而抑制其基因的表達(dá)．同樣的可以利用RdDM防御外源DNA序列(包括各種RNA病毒和DNA病毒)的入侵，這被認(rèn)為是植物維持基因組穩(wěn)定性的保護(hù)機(jī)制．

3 DNA病毒編碼的基因沉默抑制子的功能

植物既可以通過RdDM途徑防御外源DNA序列的入侵，也能夠通過RdDM途徑抑制病毒的侵染和復(fù)制．而病毒在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中利用自身編碼的蛋白與宿主的防御途徑中的蛋白進(jìn)行互作，并通過抑制某些效應(yīng)蛋白來對(duì)抗宿主的防御機(jī)制，最終達(dá)到病毒自身能夠在宿主植物中進(jìn)行復(fù)制，積累的目的．自從發(fā)現(xiàn)第一個(gè)由植物病毒編碼的基因沉默抑制子HC-Pro以來，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多個(gè)基因沉默抑制子．國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，病毒編碼的沉默抑制子通過和宿主內(nèi)源的蛋白互作，來抑制宿主對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄基因沉默反應(yīng)．例如，AL2/AC2或L2/C2是雙生病毒反義鏈編碼的一個(gè)蛋白，被認(rèn)為參與了植物基因沉默相關(guān)的抗病毒防御反應(yīng)[17-18]．他們的研究還發(fā)現(xiàn)TGMV AL2和BCTV L2能夠抑制SNF1和ADK2 的活性，其研究表明，AL2/L2蛋白可能通過調(diào)節(jié)植物代謝過程和影響轉(zhuǎn)甲基化循環(huán)來對(duì)抗宿主的沉默反應(yīng)[19-20]．

4 展望

關(guān)于植物RNA沉默機(jī)制、病毒基因沉默抑制子的功能，以及植物病毒與宿主的互作機(jī)制等研究越來越深入，我們對(duì)這些科學(xué)問題的認(rèn)識(shí)也日益清晰．RNA沉默存在于植物等大多數(shù)真核生物中，能夠引起基因表達(dá)的阻斷，參與調(diào)控基因表達(dá)、抗病毒和環(huán)境脅迫反應(yīng)等諸多過程[21-23]．基因沉默抑制子的發(fā)現(xiàn)不僅為研究基因沉默機(jī)制提供了一個(gè)切入點(diǎn)，而且為人們對(duì)植物的防御機(jī)制的深入研究提供了有力證據(jù)．人們對(duì)RNA沉默機(jī)制的了解更加有利于我們對(duì)真核生物基因表達(dá)及其調(diào)控的理解，而且對(duì)這些科學(xué)問題的認(rèn)識(shí)將為今后的抗病毒育種工作帶來新的啟迪．

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