鳳尾草抗糖尿病活性成分的研究

姚學軍， 孟素蕊， 王 喆

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211)

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草，別名井欄邊草的干燥全草，多分布于華北、中南、華東、華南、西南地區(qū)。民間及臨床用全草清熱利濕、抗菌消炎、消腫止痛、涼血止血，其根莖用于治療糖尿病、抗腫瘤效佳。文獻報道其主要化學成分為黃酮［1-2］，以及對映貝殼杉烷型二萜［3-5］。本實驗運用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜的方法從鳳尾草乙醇浸膏中分離鑒定了9 個化合物，包括黃酮苷類化合物，二萜類化合物、倍半萜類化合物及三萜類化合物，其中化合物7 ～9 為首次從該植物中分離得到，此外，本實驗對分離得到的黃酮苷類化合物進行了兩種細胞活性的篩選，結果顯示化合物2 具有較強的抗糖尿病活性。

1 儀器與材料

Bruker AV 400 核磁共振儀(TMS 內(nèi)標);JASCO 半制備高效液相色譜儀(PU-2089，RI-2031，UV-2075，日本分光公司);YMC-Pack ODS-A SH-343-5 色譜柱(20 mm ×250 mm，5 μm);A sahipak GS-20G H200142，H200143 色譜柱(20 mm ×500 mm，5 μm);UV-3310 型紫外-可見分光光度計(日本Hitachi);柱色譜和薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱(Heal Force 公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);全自動酶標板分析儀(BIO-RAD 公司);倒置顯微鏡(Olympus 公司);所用試劑均為分析純;氘代試劑(Aldrich 公司);含酚紅或不含酚紅DMEM 培養(yǎng)液(北京四環(huán)科技公司);胎牛血清(FBS)，PBS (HyClone);葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);25% (含EDTA)胰蛋白酶(Bioind);胰島素(法國Lily 公司);HepG2 細胞(中科院上海細胞庫);AMPK 及ACC 抗體(美國CST 公司)。

鳳尾草Pteris multifida Poir 采自湖南(2005 年4 月)，由中南民族大學生命科學院萬定榮教授鑒定，標本(D20050419)存放于天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科中藥房。

2 實驗方法

2.1 提取分離 取自然干燥的鳳尾草全草3.0 kg，粉碎后用75%的乙醇加熱回流提取3 次，每次6 h，提取液減壓濃縮，得浸膏400 g，將浸膏以水混懸，依次用水飽和的石油醚(60 ～90 ℃)、醋酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物42 g，醋酸乙酯提取物25 g，正丁醇提取物38 g。鳳尾草石油醚提取物及乙酸乙酯提取物分別以硅膠柱層析(400 g，100 ～200 目)分離，用石油醚-乙酸乙酯(8 ∶1，6 ∶1，4 ∶1，3 ∶1，2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2，1 ∶3)，100% 乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇(95 ∶5，90 ∶10，80 ∶20)和100%甲醇依次梯度洗脫，通過TLC 合并類似組分，石油醚層分離得到7 個組分(A-G)，乙酸乙酯層分離得到5 個組分(H-L)。

組分C 經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopeal HW-40 分離，二氯甲烷-甲醇 (2 ∶ 1)洗脫，得到Fr.1 ～Fr.4，F(xiàn)r.2(879.9 mg)再經(jīng)制備高效液相色譜分離純化，得到化合物6 (6.5 mg)和化合物2 (22.6 mg);組分E 經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopeal HW-40 分離，二氯甲烷-甲醇(2 ∶ 1)洗脫，得到Fr.1 ～Fr.3，F(xiàn)r.3 (934.7 mg)再經(jīng)制備高效液相色譜及制備薄層色譜法分離純化，分別得到化合物8 (4.5 mg)和化合物9 (10.0 mg)。組分G 經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopeal HW-40 分離，二氯甲烷-甲醇(2 ∶1)洗脫，得到Fr.1 ～Fr.4，F(xiàn)r.2 (453.9 mg)再反復經(jīng)制備高效液相色譜法分離純化，分別得到化合物1 (12.1 mg)，化合物7(6.8 mg)，化合物3 (6.2 mg)，組分K 經(jīng)過凝膠滲透柱層析Toyopeal HW-40 分離，二氯甲烷-甲醇(2 ∶1)洗脫，得到Fr.1 ～Fr.4，F(xiàn)r.3 (546.9 mg)再反復經(jīng)制備高效液相色譜法及重結晶法分離純化，分別得到化合物4 (24.2 mg)，化合物5 (11.1 mg)。

2.2 胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗實驗 胰島素抵抗HepG2 細胞模型的建立及藥物處理按文獻方法［4-5］稍作改進。將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基調整細胞密度為105個/mL，轉入96孔板中。待細胞單層貼壁后，加入新配制的含有10-7mol/L 胰島素的培養(yǎng)液，并設無胰島素的空白孔，于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h 后棄去培養(yǎng)液，先用pH 4.0 的無酚紅的DMEM 洗4 次，再用無酚紅DMEM 洗2 次后，換上無血清的培養(yǎng)基37 ℃孵育24 h 后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養(yǎng)基的葡萄糖含量。實驗分別設正常細胞組、胰島素抵抗模型組、化合物處理組 (終濃度分別為1、5、10 μmol/L)。以不鋪細胞的空白孔為空白對照，計算24 h 各組細胞的葡萄糖消耗量。根據(jù)初篩3 個濃度下的葡萄糖消耗量重新設定5 個濃度進行EC50值的測定，測定的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析，以±s 表示，組間差異的顯著性采用t 檢驗方法進行，EC50的計算采用非線性擬合方法進行。

2.3 AMPK 及ACC 磷酸化水平的檢測 本實驗采用免疫印跡法(Western Blot 法)，方法簡述如下:細胞加裂解液裂解后取上清，加入5X 蛋白上樣緩沖液95 ℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后轉移至PVDF 膜上，然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后分別加入AMPK、ACC 和β-actin 的抗體，濃度為1 ∶1 000 稀釋，4 ℃過夜。再次洗膜后加入第二抗體進行反映，室溫孵育1 h，洗膜后ECL 熒光顯色和曝光。利用圖像分析系統(tǒng)確定X 線光膠片上蛋白條帶的相對灰度。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1:黃色粉末，mp 247 ～249 ℃。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.88 (1H，s，H-3)，6.21 (1H，s，H-6)，6.51 (1H，s，H-8)，8.04 (2H，d，J =8.3 Hz，H-2'，6')，7.21 (2H，d，J =8.3 Hz，H-3'，5')，12.90 (1H，br s，OH-5)，5.54 (1H，br s，H-1″)，1.10 (3H，d，J =6.1 Hz，H-6″)。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ:164.1 (C-2)，104.8 (C-3)，182.8 (C-4)，162.4 (C-5)，98.6 (C-6)，165.3 (C-7)，95.0 (C-8)，158.4 (C-9)，104.9 (C-10)，124.9 (C-1')，129.3 (C-2'，6')，117.7 (C-3'，5')，160.0(C-3')，99.9 (C-1″)，71.0 (C-2″)，71.3 (C-3″)，72.7 (C-4″)，70.8 (C-5″)，18.9 (C-6″)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［6］報道基本一致，因此鑒定化合物1 為芹菜素-4'-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物2:黃色粉末，mp 212 ～214 ℃。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.96 (1H，s，H-3)，6.46 (1H，s，H-6)，6.86 (1H，s，H-8)，8.07 (2H，d，J =8.4 Hz，H-2'，6')，7.22 (2H，d，J =8.4 Hz，H-3'，5')，12.89 (1H，br s，OH-5)，5.54 (1H，br s，H-1″)，1.10 (3H，d，J =6.1 Hz，H-6″)，5.08 (1H，J = 7.4 Hz，H-1?)。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ:164.6 (C-2)，104.8 (C-3)，183.0(C-4)，162.1 (C-5)，100.6 (C-6)，164.0 (C-7)，95.9 (C-8)，158.0 (C-9)，105.9 (C-10)，124.8 (C-1')，129.4 (C-2'，6')，117.7 (C-3'，5')，160.1 (C-3')，99.1 (C-1″)，71.0 (C-2″)，71.3 (C-3″)，72.6 (C-4″)，70.8 (C-5″)，18.9 (C-6″)，100.9 (C-1?)，74.1 (C-2?)，77.4 (C-3″)，70.5 (C-4″)，78.1 (C-5″)，61.6 (C-6″)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［6］報道基本一致，因此鑒定化合物2 為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物3:黃色粉末，mp 224 ～226 ℃。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.47 (1H，d，J =12.8 Hz，H-2)，6.21 (1H，s，H-6)，6.19 (1H，s，H-8)，7.38 (2H，d，J=8.3 Hz，H-2'，6')，6.85 (2H，d，J =8.3 Hz，H-3'，5')，12.01 (1H，br s，OH-5)，9.69 (1H，br s，OH-4')，5.02(1H，d，J =7.48 Hz，H-1″)。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ:78.5 (C-2)，42.1 (C-3)，197.6 (C-4)，163.4 (C-5)，96.2 (C-6)，165.0 (C-7)，95.2 (C-8)，162.5 (C-9)，103.2 (C-10)，128.3 (C-1')，128.1 (C-2'，6')，115.1 (C-3'，5')，157.0 (C-3')，100.2 (C-1″)，72.9 (C-2″)，77.6(C-3″)，69.5 (C-4″)，76.7 (C-5″)，60.7 (C-6″)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，因此鑒定化合物3 為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4:黃色粉末，mp ＞300 ℃。1H-NMR (CDCl3，400 MHz)δ:6.66 (1H，s，H-3)，6.19 (1H，s，H-6)，6.44(1H，s，H-8)，7.40 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2')，6.89 (1H，d，J=8.3 Hz，H-5')，7.43 (1H，dd，J =2.2，8.3 Hz，H-6')。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ:164.4 (C-2)，103.3(C-3)，182.1 (C-4)，161.9 (C-5)，99.3 (C-6)，164.7 (C-7)，94.3 (C-8)，157.8 (C-9)，104.1 (C-10)，121.9 (C-1')，113.8 (C-2')，146.2 (C-3')，150.2 (C-4')，116.5(C-5')，119.4 (C-6')。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［8］報道基本一致，因此鑒定化合物4 為木犀草素。

化合物5:無色針狀結晶 (甲醇)，mp 205.1 ～206.7 ℃。1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ:2.48 (1H，d，J=16 Hz，H-1)，1.17 (1H，d，J =7.6 Hz，H-1)，4.33 (1H，m，H-2)，2.13 (1H，m，H-3)，2.10 (1H，m，H-3)，1.70(1H，m，H-5)，1.80，1.31 (each 1H，m，H-6)，1.54，1.75 (each 1H，m，H-7)，1.43 (1H，br s，H-9)，1.58，1.39 (each 1H，m，H-11)，2.90，1.65 (each 1H，m，H-12)，2.76 (1H，br s，H-13)，4.21 (1H，br s，H-15)，5.46，5.63 (each 1H，s，H-17)，0.88 (3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，1.08 (3H，s，H-20)。13C-NMR (CDCl3，125 MHz)δ:52.7 (C-1)，64.4 (C-2)，51.0 (C-3)，35.3(C-4)，48.6 (C-5)，20.2 (C-6)，36.6 (C-7)，60.8 (C-8)，56.4 (C-9)，41.9 (C-10)，19.1 (C-11)，33.7 (C-12)，55.3 (C-13)，37.4 (C-14)，83.4 (C-15)，161.7 (C-16)，108.3 (C-17)，19.6 (C-18)，23.3 (C-19)，43.3 (C-20)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［4］ 報道基本一致，因此鑒定化合物5 為2β，5α-二羥基-(-)-16-貝殼杉烯。

化合物6:黃色粉末，mp 104 ～106 ℃。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.09 (1H，s，H-4)，3.76 (2H，t，J=7.4 Hz，H-13)，3.02 (2H，t，J =7.4 Hz，H-12)，2.68(3H，s，H-14)，2.55-2.65 (2H，m，H-3)，2.43 (3H，s，H-11)，1.27 (3H，d，J=6.3 Hz H-10)。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)δ:210.3 (C-1)，163.4 (C-2)，34.7 (C-3)，125.8 (C-4)，144.4 (C-5)，134.8 (C-6)，138.0 (C-7)，42.8 (C-8)，152.6 (C-9)，16.8 (C-10)，21.4 (C-11)，61.6 (C-12)，32.8 (C-13)，13.7 (C-14)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道基本一致，因此鑒定化合物6 為pterosin B。

化合物7:無色針狀結晶(三氯甲烷)，mp 97 ～99℃。1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ:0.71 (3H，s，H-18)，0.84 (3H，d，J =7.0，H-26)，0.86 (3H，d，J =7.0，H-27)，0.87 (3H，m，H-29)，0.94 (3H，d，J =6.5，H-21)，1.20 (3H，s，H-19)，1.38 (1H，m，H-20)，1.69 (1H，m，H-25)，5.72 (1H，s，H-4)。13C-NMR (CDCl3，125 MHz)δ:36.4 (C-1)，34.7 (C-2)，199.6 (C-3)，123.7 (C-4)，171.7 (C-5)，32.7 (C-6)，31.8 (C-7)，35.3 (C-8)，53.5(C-9)，38.3 (C-10)，20.8 (C-11)，39.3 (C-12)，42.1 (C-13)，55.6 (C-14)，23.9 (C-15)，27.8 (C-16)，55.7 (C-17)，11.7 (C-18)，17.1 (C-19)，35.9 (C-20)，20.9 (C-21)，33.6 (C-22)，25.7 (C-23)，45.5 (C-24)，28.8 (C-25)，20.9 (C-26)，18.7 (C-27)，22.8 (C-28)，11.9 (C-29)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［10］報道基本一致，因此鑒定化合物7 為24R-ethylcholest-4-en-3-one。

化合物8:無色油狀物。1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ:1.28，1.05 (each 1H，m，H-2)，1.26 (1H，m，H-3)，1.24(1H，m，H-4)，1.50 (1H，m，H-5)，1.38 (1H，m，H-6)，1.28 (1H，m，H-7)，1.34 (1H，m，H-8)，1.40 (1H，m，H-9)，1.38，1.28 (each 1H，m，H-10)，1.53 (1H，m，H-11)，1.99，1.13 (1H，m，H-12)，5.40 (1H，qt，J =1.4，7.0 Hz，H-14)，4.14 (1H，d，J = 7.0 Hz，H-15)，0.87(3H，s，H-16)，0.85 (3H，s，H-17)，0.84 (3H，d，J=7.1 Hz，H-18)，0.83 (3H，d，J=6.6 Hz，H-19)，1.66 (3H，br s，H-20)。13C-NMR (CDCl3，125 MHz)δ:36.7 (C-1)，39.5 (C-2)，24.9 (C-3)，37.4 (C-4)，28.1 (C-5)，32.9(C-6)，24.6 (C-7)，37.4 (C-8)，32.8 (C-9)，37.5 (C-10)，25.2 (C-11)，30.9 (C-12)，140.4 (C-13)，123.2 (C-14)，59.5 (C-15)，22.8 (C-16)，22.7 (C-17)，19.8 (C-18)，19.8 (C-19)，16.3 (C-20)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［11］報道基本一致，因此鑒定化合物8 為cassipourol。

化合物9:無色針狀結晶，mp 94 ～96 ℃。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:1.01 (3H，s，H-18)，0.80 (3H，s，H-29)，0.90 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.32 (1H，d，J=4.2 Hz，H-19)，0.55 (1H，d，J = 4.2 Hz，H-19)，0.91(1H，s，H-28)，3.29 (1H，dd，J =11.5，4.5 Hz，H-3)，1.67 (3H，brs，H-27)。13C-NMR (CDCl3，125 MHz)δ:32.0(C-1)，30.4 (C-2)，78.8 (C-3)，40.8 (C-4)，47.1 (C-5)，21.1 (C-6)，27.2 (C-7)，48.0 (C-8)，20.0 (C-9)，26.1(C-10)，26.1 (C-11)，35.7 (C-12)，45.8 (C-13)，48.4(C-14)，32.9 (C-15)，26.4 (C-16)，49.0 (C-17)，18.0(C-18)，29.9 (C-19)，40.5 (C-20)，12.0 (C-21)，33.6(C-22)，36.1 (C-23)，33.2 (C-24)，150.3 (C-25)，20.9(C-26)，109.7 (C-27)，19.5 (C-28)，14.0 (C-29)，25.4(C-30)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻［12］報道基本一致，因此鑒定化合物9 為cyclolaudenol。

3.2 化合物對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響本實驗對分離得到的黃酮苷類化合物進行了活性測定，利用胰島素抵抗的HepG2 細胞為體外模型，測定化合物1 ～4 對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響，結果如表1 所示，化合物1 ～4 能夠劑量依存性地促進胰島素抵抗HepG2 細胞的葡萄糖消耗。

表1 化合物1 ～4 對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響(n=3)

根據(jù)初步活性結果，確定了EC50的濃度測定范圍，對化合物1 ～4 進行了EC50濃度測試，測試濃度分別為(1、5、10、50、100 μmol/L)。結果見表2。

表2 化合物1 ～4 對胰島素抵抗HepG2 細胞葡萄糖量的EC50值

3.3 化合物2 對胰島素抵抗HepG2 細胞Akt 磷酸化水平的影響 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種重要的蛋白激酶，主要作用是協(xié)調代謝和能量平衡。AMPK 被激活后在增加葡萄糖攝取、增強胰島素敏感性、增加脂肪酸氧化以及調節(jié)基因轉錄等方面發(fā)揮重要作用［13］。本實驗利用胰島素抵抗的HepG2 細胞，測定化合物2 在濃度分別為1、5、10 μmol/L 下對胰島素抵抗狀態(tài)下HepG2 細胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及其下游底物乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)的磷酸化水平，實驗結果如圖1 所示，化合物2 能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2 細胞AMPK 及其下游底物ACC 的磷酸化水平，并呈現(xiàn)劑量依賴性，顯示化合物2 可能通過提高AMPK 磷酸化水平來提高葡萄糖消耗，提示化合物2 具有一定的抗糖尿病活性。

圖1 化合物2 的不同濃度對胰島素抵抗HepG2 細胞AMPK 及ACC 磷酸化水平的影響(n=3)

4 討論

本實驗從鳳尾草石油醚和乙酸乙酯極性部位提取分離得到9 個化合物，其中化合物7 ～9 為首次從該植物中分離得到。根據(jù)鳳尾草治療糖尿病的臨床應用以及文獻報道黃酮及黃酮苷類化合物具有顯著的抗糖尿病活性［14-16］，本實驗以胰島素抵抗HepG2 細胞對黃酮類化合物1 ～4 進行抗糖尿病作用的初步篩選，初步篩選結果表明，黃酮苷類化合物2 能夠顯著提高胰島素抵抗的HepG2 細胞葡萄糖消耗量;進一步對AMPK 及其下游底物ACC 磷酸化水平評價表明，化合物2 能顯著提高胰島素抵抗HepG2 細胞AMPK 及ACC 磷酸化水平，改善胰島素抵抗，提高細胞對葡萄糖的利用，顯示了明確的體外抗糖尿病作用。本實驗首次利用胰島素抵抗的HepG2 細胞模型對鳳尾草的抗糖尿病活性進行了初步研究，為中藥鳳尾草的抗糖尿病應用提供了實驗依據(jù)。

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