鎖陽多糖對H2O2 誘導非洲綠猴腎上皮細胞氧化損傷的保護作用

劉 琴， 宋 珅， 郭 杰， 羅 順， 張 繼，2*

(1. 西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070;2. 甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心，甘肅 蘭州730070;3. 甘肅萬州建順生物科技有限公司，甘肅 蘭州730070)

鎖陽又名不老藥，是鎖陽科植物Cynomorium songaricum Ruhr 的干燥肉質莖。其性甘溫，具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功能。臨床用于腰膝痿軟，陽痿滑精，腸燥便秘等。目前對鎖陽的報道以多糖類物質居多，如多糖的提取工藝研究［1］，多糖對染色體端粒長度的影響［2］，然而關于其抗氧化活性檢測方面鮮有報道。鎖陽主要有有機酸、黃酮類、三萜類、甾體類、揮發(fā)性成分、氨基酸類、糖類、縮合型鞣質等多種化學成分［3-4］，其中多糖類物質的體外清除自由基的作用已有研究［5］，但是關于細胞水平的研究鮮有報道。H2O2是一種常用的細胞氧化應激誘導劑，廣泛用于誘導細胞建立氧化應激模型［6］。VERO 細胞株即非洲綠猴腎上皮細胞，生長迅速，性狀穩(wěn)定，對藥物敏感，且最重要的一點是猿猴較接近人類，用該細胞進行腎臟疾病方面的研究可以減少免疫學方面的問題［7］。故本研究采用VERO 細胞建立氧化損傷模型，旨在研究鎖陽多糖是否對VERO 細胞氧化損傷具有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料 鎖陽，產地為甘肅酒泉，60 ℃，24 h烘干，粉碎，過100 目篩，備用。

非洲綠猴腎上皮(VERO)細胞購自ATCC。DMEM -F12 培養(yǎng)基和新生牛血清(Gibco 公司);青霉素(華北制藥股份有限公司);鏈霉素(大連美羅大藥廠);MTT (Sigma-Aldrich 公司);超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ROS 活性檢測試劑盒和Caspase-3 活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所);其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 公司);Vi-cell 細胞計數分析儀(Beckman 公司);生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);倒置顯微鏡 (OLYMPUS 公司);SpectraMax M5 酶標儀(美國分子儀器有限公司);UV2450 紫外分光光度計(上海美析儀器有限公司);熒光分光光度計(上海精密儀器有限公司);高速低溫離心機(Beckman 公司);電子天平(天津市天馬儀器廠);超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 鎖陽多糖的制備 取一定量的粉碎好的鎖陽粉末，按照張思巨等［8］的方法分離和純化鎖陽多糖，苯酚硫酸法［9］測得含糖量為89.2%，凝膠阻滯色譜法［10］測得其相對分子質量為48.1 ×104(Mw)，GC-MS 法分析［11］表明，鎖陽多糖由Man、Glu 和Gal 3 種單糖組成，摩爾比為5.01 ∶89.17 ∶5.82。

1.3.2 VERO 細胞復蘇與培養(yǎng) 將凍存的VERO細胞從液氮罐中取出，迅速在37 ℃水浴中融化。根據凍存密度，接種1 ×106個于含10%小牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基的75 cm2T-FLASK 培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。

當細胞長滿瓶底后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌兩次;然后用0.25%的胰酶消化，3 ～5 min 后于倒置顯微鏡下觀察消化程度;大部分細胞變圓，細胞間連接疏松，表明消化適度，加入少量含10%小牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液終止消化;吹打，制成單細胞懸液。取少量懸液通過Vi-cell測試細胞密度，接種所需的密度于培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中進行后續(xù)試驗。

1.3.3 H2O2誘導VERO 細胞氧化損傷模型的建立

參照張生等［12］的實驗方法，將生長于對數期的VERO 細胞按照1 ×104個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入濃度梯度為100、200、400、800、1 000 μmol/L 的H2O2，每組4 個復孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育0.5、1、1.5、2 h，MTT 法檢測細胞存活率，選擇細胞存活率接近50%時的H2O2的濃度作為最佳作用濃度。

1.3.4 鎖陽多糖對正常VERO 細胞的影響 將生長于對數期的VERO 細胞按照密度為1 ×104個/孔接種于96 孔板中，待細胞貼壁后用于實驗。實驗分6 組，空白對照組、鎖陽多糖0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 mg/mL 劑量組，在37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入MTT液(PBS 液配制，終質量濃度為0.5 mg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入異丙醇，吹打至藍色結晶物完全溶解，酶標儀測570 nm 處吸光度(A)。細胞存活率(%) =［A570(樣品組)/A570(空白對照組2)］ × 100%。

1.3.5 鎖陽多糖對H2O2誘導VERO 細胞氧化損傷的保護作用 細胞處理同“1.3.4”項。待細胞貼壁后加入等體積250、500 和1 000 μg/mL 的鎖陽多糖，每組6 復孔。分別孵育8、12、24 h 后，加入終濃度為800 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)孵育1 h后，MTT 法檢測細胞存活率。

1.3.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出量的測定 細胞處理同“1.3.5”項。細胞經多糖處理后，H2O2處理1 h，收集上清液，嚴格按照LDH 試劑盒說明測試LDH 釋放量。440 nm 處測吸光值。LDH 釋放量用總LDH 活性(培養(yǎng)基中的LDH + 細胞內的LDH)的百分比來表示，計算公式:LDH 釋放量(%)=(培養(yǎng)基LDH 活性/總LDH 活性)×100%

1.3.7 熒光光度法檢測caspase-3 活性 細胞處理同“1.3.5”項，處理完成后，1 000 ×g，4 ℃離心5 min 收集細胞，PBS 洗滌1 次。取2 ×106個細胞加入100 μL 裂解液，冰浴裂解15 min。4 ℃，16 000 ～20 000 ×g 離心10 ～15 min，將上清轉移到預冷的離心管中。取出10 μL 加入反應體系37 ℃溫育，變色以后，于405 nm 測吸光度，嚴格根據產品說明書操作。

1.3.8 DCFH-DA 熒光探針檢測細胞內ROS 水平細胞處理同“1.3.5”項。細胞經多糖處理后，H2O2處理1 h，收集細胞，加入終濃度為10 μmol /L的DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)液1 mL，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。每隔3 ～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，充分除去未進入細胞內的DCFH-DA。熒光分光光度計測定 (激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為521 nm)細胞內熒光強度。

1.3.9 抗氧化指標的測定 細胞處理同“1.3.5”項。細胞經多糖處理后，H2O2處理1 h，收集細胞，超聲破碎細胞，根據GSH-Px、SOD 和MDA 試劑盒說明，檢測VERO 細胞內GSH-Px、SOD 活性和細胞培養(yǎng)液中MDA 水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計學處理，采用獨立樣本t 檢驗和單因素方差分析檢驗差異顯著性。各組數據用(±s)表示。

2 結果與分析

2.1 H2O2對VERO 細胞存活率的影響 結果如圖1 所示，不同濃度的H2O2分別處理VERO 細胞0.5、1、1.5、2 h 后，細胞存活率顯著下降(*P ＜0.05，#P ＜0.01)，有劑量依賴性和時間依賴性。根據IC50規(guī)則，符合進一步實驗要求的損傷時間和損傷濃度分別為:100 μmol/L 處理2 h，400 μmol/L 處理1.5 h，800 μmol/L 處理1 h，以此建立VERO 細胞的氧化損傷模型。在這3 個時間，細胞損傷程度均在50%左右，這樣既能使細胞受到明顯的損傷，又不至于造成細胞的過度凋亡，有利于進一步實驗的探討。

2.2 鎖陽多糖對正常VERO 細胞的影響 由表1可以看出，與對照組相比，鎖陽多糖預處理24 h對正常的VERO 細胞的活力沒有明顯的影響。

2.3 鎖陽多糖對H2O2誘導VERO 細胞氧化損傷的保護作用 如圖2 所示，與對照組相比，H2O2能明顯降低VERO 細胞的存活率(##P ＜0.01)。與H2O2模型組相比，不同質量濃度 (0.25 ～1 mg/mL)的鎖陽多糖預處理12、24 h，能夠明顯改善H2O2引起的VERO 細胞存活率的降低(＊＊P ＜0.01)，并且有劑量依賴性。預處理8 h，其保護作用不明顯。

圖1 不同濃度H2O2 對VERO 細胞增殖的影響(n=6)Fig.1 Effect of different concentrations of H2O2 on proliferation of VERO cells (n=6)

表1 鎖陽多糖對正常VERO 細胞OD 值的影響(n=6)Tab.1 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the OD of VERO cells (n=6)

圖2 不同質量濃度的鎖陽多糖對H2O2 損傷VERO 細胞存活率的影響(n=6)Fig.2 Effect of different concentrations of polysaccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced viability of VERO cells (n=6)

2.4 鎖陽多糖對H2O2損傷VERO 細胞的LDH 漏出量的影響 由圖3 所示，與對照組相比，H2O2模型組的LDH 漏出量明顯增加(##P ＜0.01)，說明H2O2對VERO 細胞造成損傷，使得細胞中的乳酸脫氫酶(LDH)釋放到了細胞培養(yǎng)液中。與模型組相比，加入鎖陽多糖處理后，能明顯降低LDH 漏出量(＊＊P ＜0.01)，并且隨著鎖陽多糖質量濃度的升高。LDH 漏出量減少，表現出一定的劑量依賴性，表明鎖陽多糖能夠保護細胞免受H2O2的損傷。

圖3 不同質量濃度的鎖陽多糖對H2O2 損傷的VERO 細胞LDH 漏出量的影響(n=6)Fig.3 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on LDH leakage of VERO cells injured by H2O2 (n=6)

2.5 caspase-3 活性檢測VERO 細胞凋亡 如圖4所示，與對照組相比，細胞經800 μmol/L H2O2處理1 h 后，caspase-3 活性明顯升高(#P ＜0.01)，表明H2O2誘導VERO 細胞發(fā)生了凋亡，而鎖陽多糖自身對caspase-3 的活性沒有影響。與模型組相比，在用H2O2誘導損傷之前，細胞經不同質量濃度(0.5、1 mg/mL)鎖陽多糖預處理后，caspase-3 活性劑量依賴性的降低(＊＊P ＜0.01)，表明鎖陽多糖能夠保護細胞免于H2O2損傷，間接抑制細胞凋亡。

2.6 鎖陽多糖對H2O2誘導VERO 細胞內ROS 水平影響 如圖5 所示，與對照組相比，H2O2模型組的ROS 水平明顯升高(##P ＜0.01)，表明H2O2能誘導VERO 細胞產生ROS，而與模型組相比，不同質量濃度的鎖陽多糖能夠明顯降低ROS 水平(＊＊P ＜0.01)，并且隨著鎖陽多糖質量濃度的增加，ROS 水平降低越明顯，表明鎖陽多糖能夠顯著抑制H2O2誘導VERO 細胞產生活性氧。

圖4 鎖陽多糖對H2O2 誘導的VERO 細胞的caspase-3 活性的影響(n=6)Fig.4 Effect of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced activation of caspase-3 of VERO cells (n=6)

圖5 不同質量濃度的鎖陽多糖對H2O2 損傷的VERO 細胞內ROS 水平的影響(n=6)Fig.5 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced intracellular accumulation of ROS in VERO cells (n=6)

2.7 抗氧化指標的測定結果 表2 數據顯示，與對照組相比，模型組的MDA 水平顯著升高(#P ＜0.01);SOD 和GSH-Px 活力顯著降低(#P ＜0.01)，說明H2O2對VERO 細胞造成了損傷，使得細胞培養(yǎng)液中MDA 水平升高，使得細胞內SOD 和GSH-Px活力降低，清除自由基能力下降。與H2O2模型組相比，多糖組的MDA 水平降低(＊＊P ＜0.01)，SOD 和GSH-Px 活力升高(＊＊P ＜0.01)，表明鎖陽多糖具有抗氧化能力。

表2 鎖陽多糖對SOD 和GSH-Px 活性以及MDA 水平影響(n=6)Tab.2 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the activities of SOD，GSH-Px and MDA of VERO cell (n=6)

3 討論

正常的VERO 細胞自身擁有一套清除自由基的酶系統(tǒng)，能將新陳代謝中生成的自由基清除，當細胞受到外界的氧化損傷時，細胞產生的自由基超過了其自身的自由基清除能力，過多的自由基使得細胞膜中的不飽和脂肪酸被氧化，導致細胞膜的液態(tài)性、流動性和通透性均發(fā)生變化，最終使膜功能發(fā)生障礙，引發(fā)腎結石等疾病［13］。由于腎臟疾病難以在原位進行研究，利用體外培養(yǎng)腎上皮細胞建立氧化損傷模型，避免了全身神經體液、激素水平及局部不同類型細胞間的相互影響，為更深入的從細胞水平研究腎臟疾患提供了良好的模型［14］。

本實驗研究通過利用H2O2誘導的VERO 細胞損傷模型，研究鎖陽多糖對VERO 細胞氧化損傷的保護作用。實驗結果表明，H2O2對VERO 細胞具有氧化損傷作用，其損傷程度呈現時間依賴性(0 ～2 h)和劑量依賴性(0 ～1 mg/mL)。其中800 μmol/L 處理1 h 可使VERO 細胞產生顯著的損傷，而分離純化的鎖陽多糖可顯著提高經H2O2損傷后的VERO 細胞的存活率，使得損傷性VERO細胞LDH 的漏出量顯著降低，這可能是因為鎖陽多糖對VERO 細胞膜起到了保護作用，從而阻止了LDH 很快釋放到細胞培養(yǎng)上清液中。

活性氧如過氧化氫和羥自由基容易破壞生物分子，這可能最終導致細胞凋亡或壞死［15］。通過抗氧化劑去除多余的活性氧或抑制其生成可以有效地防止細胞氧化。本實驗結果表明鎖陽多糖能夠明顯降低由H2O2引起的VERO 細胞內ROS 水平的變化，并且有劑量依賴性。此外，H2O2處理后的VERO 細胞內caspase-3 活性明顯升高，經鎖陽多糖預處理后，caspase-3 活性劑量依賴性的降低，這表明鎖陽多糖能夠間接抑制H2O2引起的VERO細胞的凋亡，其具體的作用機制有待進一步研究。

抗氧化指標測定結果顯示，模型組的SOD 和GSH-Px 活性顯著下降，MDA 水平顯著升高。而不同質量濃度的鎖陽多糖處理后各組的抗氧化酶活性均有所升高，MDA 水平均降低，并且隨著多糖質量濃度增大，作用越顯著，這表明鎖陽多糖能夠提高VERO 細胞的抗氧化能力。

綜上所述，本研究通過使用H2O2建立VERO細胞氧化應激損傷模型，觀察鎖陽多糖對氧化應激損傷的保護作用，發(fā)現鎖陽多糖可以増加細胞內抗氧化系統(tǒng)的活性，調節(jié)細胞內抗氧化酶活性，維持細胞內抗氧化系統(tǒng)的正常水平，明顯減少細胞內活性氧簇的形成，并顯示出抗凋亡作用。這些綜合作用的結果，可能就是鎖陽多糖能夠起到保護VERO細胞作用的重要因素，這個結果為進一步研究鎖陽多糖潛在的防治腎臟相關疾病展示了樂觀的前景。

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