魯米諾化學發(fā)光法測定食品中的亞硫酸鹽

王建清， 徐麗紅， 張 玉， 王 偉， 胡 棋

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江杭州 310021）

魯米諾化學發(fā)光法測定食品中的亞硫酸鹽

王建清， 徐麗紅*， 張 玉， 王 偉， 胡 棋

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江杭州 310021）

提出了運用化學發(fā)光法測定食品中亞硫酸鹽的新方法，對影響化學發(fā)光的諸因素進行了實驗和探討，得出較佳檢測條件：方法的定量限為4.6mg/kg，亞硫酸鹽質(zhì)量濃度在1.0～10.0mg/ L與發(fā)光強度增強值（ΔI）呈良好的線性關(guān)系，R2為0.993 4.對6類樣品進行了測定并做加標回收試驗，平均RSD 3.05%，平均回收率93.0%，可用于食品中亞硫酸鹽的定量與定性檢測.

魯米諾試劑；亞硫酸鹽；化學發(fā)光

食品中亞硫酸鹽殘留指標是國家質(zhì)檢部門的嚴控指標之一.在食品加工過程中，人為或非人為的因素都會導致諸多食品中亞硫酸鹽的含量超出國家標準，如何控制亞硫酸鹽含量是各食品生產(chǎn)加工企業(yè)和質(zhì)檢機構(gòu)面臨的一大難題.為了解決食品中亞硫酸鹽殘留超標問題，各食品生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量監(jiān)督部門都必需對食品中的亞硫酸鹽進行檢測.目前對食品中亞硫酸鹽的檢測主要有國標 GB/T 5009.34—2003［1］中規(guī)定的鹽酸副玫瑰苯胺比色法，其主要原理是利用亞硫酸鹽與四氯汞鈉的反應(yīng)生成穩(wěn)定的絡(luò)合物，再與甲醛及鹽酸副玫瑰苯胺作用生成紫紅色絡(luò)合物，在波長550 nm處測定溶液吸光度，與標準系列比較定量，方法十分完善可靠，靈敏度符合要求，其不足之處是操作繁雜，耗時.測定亞硫酸鹽的其他方法有電導滴定法［2］、離子色譜法［3］、流動注射化學發(fā)光法［4］、氣相色譜法［5］、近紅外光譜法［6］等，這些方法在某些領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用［7-18］.魯米諾（Luminol，3-氨基苯二甲酰肼）是人們公認的最有效的化學發(fā)光物質(zhì)之一，在堿性介質(zhì)中，亞硫酸鹽能夠有效增強魯米諾-過氧化氫體系的化學發(fā)光，且在一定的濃度范圍內(nèi)，與化學發(fā)光強度呈良好的線性關(guān)系，可應(yīng)用于亞硫酸鹽的檢測.魯米諾化學發(fā)光法作為測定食品中亞硫酸鹽的方法具有快速簡便、無需復雜精密儀器、靈敏度較高等特點，具有一定的應(yīng)用價值.

本文研究了魯米諾-過氧化氫體系與亞硫酸鹽的各種反應(yīng)條件，建立了一種快速、簡便測定亞硫酸鹽殘留量的檢測方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

BHP-9504型系列微孔板化學發(fā)光分析儀，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司；96孔微孔板（黑板），美國康寧公司生產(chǎn)；分析天平（感量0.000 1 g，0.1 g）；超聲波儀；200μL移液槍.

1.2 標準溶液及試劑的配制

Na2SO3標準溶液（100mg/L，以二氧化硫計）：稱取0.019 7 g Na2SO3用水溶解定容至100mL，冷藏保存.用時稀釋至需要濃度.

Luminol（Fluka公司）儲備液（1.0×10-2mol/L）：稱取0.442 9 g魯米諾，用0.1 mol/L NaOH溶解定容至250mL，避光保存；用時稀釋至需要濃度.

H2O2儲備液（1.0×10-3mol/L）：由13.0 mol/L 的H2O2直接稀釋而成，當天配制.

Cu2+儲備液（1.0×10-2mol/L）：稱取0.2497 g CuSO4·5H2O，用二次水溶解定容至100m L，用時稀釋成所需濃度.

0.1mol/L NaOH溶液：稱取氫氧化鈉4.0 g，用水溶解并定容到1 L.

所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水.

1.3 樣品前處理

稱取1.0 g干燥粉碎后的樣品于100m L容量瓶中，加30mL水，1.0mL 0.1mol/L NaOH溶液，超聲15 min，然后用水定容，過濾后備用.

1.4 樣品檢測步驟

用200μL移液槍分別吸取40μL亞硫鹽酸標準系列溶液（1.0～10.0 mg/L）、1.0×10-3mol/L H2O2溶液和1.0×10-3mol/L Luminol試劑于96孔微孔板中（不要顛倒加樣順序），立即置入化學發(fā)光儀中，1 min后讀取發(fā)光值.同時讀取空白值（用水代替亞硫鹽酸標準溶液），計算化學發(fā)光值差值ΔI.以亞硫鹽酸標準溶液與ΔI制作標準工作曲線，同時讀取樣品ΔI，用標準工作曲線計算樣品中亞硫鹽酸含量（以二氧化硫計）.

2 實驗方法

2.1 化學發(fā)光讀取時間曲線

亞硫酸鹽對Luminol-H2O2-Cu2+反應(yīng)體系的化學發(fā)光有很強增敏作用，Cu2+作為催化劑使Luminol試劑迅速從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，并發(fā)出光能，發(fā)光從混合后開始為最大值隨即迅速衰減至基線，可見該體系為快速發(fā)光體系.用200μL移液槍分別吸取40μL 100mg/L亞硫鹽酸標準溶液、1.0×10-3mol/L H2O2溶液、1.0×10-2mol/L Cu2+儲備液和1.0×10-2mol/L Luminol試劑于96孔微孔板中，立即置入化學發(fā)光儀中，每間隔10秒測定一次化學發(fā)光值，繪出圖1（Luminol-H2O2-Cu2+反應(yīng)體系的發(fā)光時間曲線）.從圖1可見，發(fā)光值隨測定時間不斷變化，無法實現(xiàn)定量測定.可見Cu2+作為催化劑，具有較強的化學發(fā)光體系增敏作用，且該體系極不穩(wěn)定.

2.2 化學發(fā)光反應(yīng)體系及讀取時間的選擇

圖1 加Cu2+發(fā)光值讀取時間曲線Fig.1 Illumination values at different time points

按實驗方法2.1，不加Cu2+，可降低反應(yīng)速度，有利于讀取穩(wěn)定的化學發(fā)光值，并每隔10秒測定一次發(fā)光值繪制圖2.從圖2得出，化學發(fā)光值從加樣始為最大，隨即迅速降低，至60秒后基本趨于穩(wěn)定.故選擇不加Cu2+且加樣后60秒為讀取化學發(fā)光值時間.

圖2 不加Cu2+發(fā)光讀取時間曲線Fig.2 Lightemitting values at different time points

2.3 魯米諾濃度的選擇

按實驗方法2.1，不加 Cu2+，研究了不同濃度的魯米諾（1.0×10-4～1.5×10-3mol/L）對發(fā)光值的影響（見圖3）.實驗結(jié)果表明當魯米諾濃度增大，發(fā)光值逐步增加，到1.0×10-3mol/L時，達到最大值；濃度繼續(xù)增加，發(fā)光強度還會增加，但其重現(xiàn)會變差，因此實驗選擇魯米諾濃度為1.0×10-3mol/L.

圖3 Luminol試劑濃度對發(fā)光值的影響Fig.3 Illumination values under different luminol reagent concentrations

2.4 過氧化氫濃度的選擇

按實驗方法2.1，僅改變H2O2的濃度進行實驗，當H2O2的濃度在1.0×10-4～2.0×10-3mol/L內(nèi)變化時，發(fā)光強度逐步增加，到1.0×10-3mol/L時基本達到最大值（見圖4），故選擇H2O2的濃度為1.0×10-3mol/L.

圖4 H2 O2試劑濃度對化學發(fā)光值的影響Fig.4 Chemiluminescence values under different H2 O2 reagent concentrations

2.5 提取超聲時間的選擇

按1.3實驗前處理條件，選擇超聲時間為15，30，45，60，75，90 min，再按1.4實驗方法并讀取化學發(fā)光值，制作提取時間與化學發(fā)光值曲線如圖5.從圖5可知，超聲時間對化學發(fā)光值變化不大，超聲15min已能提取樣品中的亞硫酸鹽，故選擇最短超聲時間為15min.

圖5 提取時間與化學發(fā)光值曲線Fig.5 Chemiluminescence values at differentthe extraction times

2.6 實驗結(jié)果

樣品提取選取堿性條件（加氫氧化鈉），用水超聲提取時間15 min，魯米諾濃度確定為1.0×10-3mol/L，過氧化氫濃度確定為1.0×10-3mol/L，所有試劑及樣品加入后60 s為儀器讀取發(fā)光值時間.

2.7 線性關(guān)系與方法檢出限、精密度2.6

按實驗條件，以亞硫酸鹽的濃度與發(fā)光值ΔI繪工作曲線，見圖6.亞硫酸鹽濃度在1.0～10.0 mg/L時，化學發(fā)光值與亞硫酸鹽濃度呈良好的線性關(guān)系.其線性回歸方程為y=435.82x-37.647，相關(guān)系數(shù)R2為0.993 4.對香菇樣品平行測定10次，相對標準偏差RSD 3.59%.以標準曲線截距3倍計算最低檢出濃度，最低檢出質(zhì)量比為2.3mg/kg，定量限則為4.6mg/kg.

圖6 標準工作曲線Fig.6 Standard curve of sulfite concentration and luminous intensity

2.8 實際樣品測定及回收率

取市售香菇、銀耳、腐竹、腰果仁、新竹米粉、開心果樣品若干，制樣后按方法2.6檢測（6次重復測定），測得樣品中亞硫鹽殘留量（平均值），并計算相對標準偏差RSD，做加標試驗，測定加標后測出量（2次重復測定），計算回收率，結(jié)果見表1.

表1 樣品亞硫酸鹽測定結(jié)果及回收率Tab.1 Results of samples determination and sulfite recoveries

3 結(jié)果與討論

本文運用近年來廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、藥物、食檢、環(huán)境和材料科學等領(lǐng)域的化學發(fā)光技術(shù)，建立了測定食品中亞硫酸鹽的一種簡便方法.方法是對原有的流動注射化學發(fā)光法的改進，取消了原先需要的流動注射裝置，簡化了儀器設(shè)備及操作程序，使其更加快速簡便.方法的定量限為4.6 mg/kg，回收率93.0%，實際樣品測定結(jié)果相對相差10%以下，線性關(guān)系良好，R2為0.993 4，滿足檢測要求，樣品濃度更低的還可定性測定，整個檢測過程在半小時以內(nèi).由于化學發(fā)光反應(yīng)體系較不穩(wěn)定，化學發(fā)光值會隨著時間迅速變化，檢測過程需注意的是化學發(fā)光值ΔI儀器讀取時間的一致性，以確保結(jié)果重現(xiàn).本法建議在基層實驗室和農(nóng)貿(mào)市場化驗室推廣應(yīng)用.

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Determ ination of Sulfite in Foods Based on Lum inol Chem ilum inescence

WANG Jian-qing， XU Li-hong*， ZHANG Yu， WANGWei， HU Qi
（Institute of Quality and Standard for Agro-Products，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

The chemiluminescence technology was selected to establish a new method for the determination of sulfites in foods.Various factors affecting the chemiluminescence detection were evaluated and the optimum determination conditions were obtained in this study.The detection limit of themethod was4.6 mg/kg.In the range of 1.0-10.0 mg/L，the sulfite concentration was positively correlated with the luminous intensity value（ΔI），and the correlation coefficient（R2）was0.993 4.Spike recovery tests of six different samples were evaluated.The average RSD was 3.05% and the average recovery was 93.0%.Chemiluminescence determination results indicated that the new method was a good candidate for the qualitative and quantitative analysis of sulfites in foods.

luminol reagent；sulfite；chemiluminescence

檀彩蓮）

TS207.5；O657.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.012

2095-6002（2014）01-0065-04

王建清，徐麗紅，張玉，等.魯米諾化學發(fā)光法測定食品中的亞硫酸鹽.食品科學技術(shù)學報，2013，32（1）：65-68. WANG Jian-qing，XU Li-hong，ZHANG Yu，et al.Determination of sulfite in foods based on luminol chemiluminescence. Journal of Food Science and Technology，2014，32（1）：65-68.

2013-07-16

浙江省科技廳重大科技專項（2009C12052）；浙江省農(nóng)業(yè)科學院重點實驗室前瞻性項目（2009C32093）.

王建清，男，實驗師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)測試研究工作；*徐麗紅，女，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及檢測方面的研究.通訊作者.