辣椒耐熱基因的AFLP分析

何鐵光，魏源文，龔明霞，鄧智年，董文斌，張朝明，趙坤（.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧，50007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所；.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室）

辣椒耐熱基因的AFLP分析

何鐵光1，2，魏源文3，龔明霞1，鄧智年3，董文斌1，張朝明1，趙坤1
（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧，530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所；3.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室）

用辣椒耐熱自交系A(chǔ)11和熱敏自交系B22配置雜交組合，通過(guò)高溫脅迫處理鑒定其F2代分離群體的耐熱性。從123對(duì)Taq I/Ase I引物組合中篩選出6對(duì)多態(tài)性好的引物對(duì)F2代耐熱、熱敏植株進(jìn)行AFLP分析，共擴(kuò)增出約11 400條清晰條帶，其中2條為穩(wěn)定的差異，初步獲得了2個(gè)與辣椒耐熱性狀相關(guān)的AFLP分子標(biāo)記。研究有助于開展辣椒耐熱基因的分子標(biāo)記輔助選擇工作，提高辣椒育種效率和水平，并為分離和克隆辣椒耐熱相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)。

辣椒；耐熱基因；AFLP分析

辣椒（Capsicum annuum L.）原產(chǎn)于中南美洲，屬于茄科（Solanaceac）辣椒屬（Capsicum）。辣椒是重要蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、富含維生素C等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而深受人們喜愛(ài)[1]。我國(guó)是世界辣椒種植面積最大的國(guó)家，國(guó)內(nèi)的種植面積僅次于大白菜，屬于第二大蔬菜作物。近年來(lái)，辣椒在華南地區(qū)也有了較大的種植面積，但廣西、海南等省份地處熱帶、亞熱帶地區(qū)，四季高溫多雨，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育造成了極大的影響，當(dāng)氣溫高于35℃時(shí)，辣椒開花及結(jié)實(shí)均受到了明顯的影響，大大降低了辣椒的品質(zhì)和產(chǎn)量。近10多a來(lái)，已有不少學(xué)者對(duì)高溫脅迫下辣椒的植株形態(tài)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究，但從分子水平系統(tǒng)研究辣椒耐熱特性的報(bào)道較少[2～6]。本研究以辣椒耐熱高代自交系A(chǔ)11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株為材料，進(jìn)行了耐高溫脅迫后，選擇耐熱和熱敏的植株進(jìn)行AFLP分析，尋找與辣椒耐熱性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為辣椒耐熱相關(guān)功能基因的克隆分析及進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為辣椒耐熱高代自交系A(chǔ)11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株，采用大棚栽培和人工氣候箱盆栽方式種植。試驗(yàn)所需生化試劑、酶類購(gòu)自南寧宏泰、Fermentas公司及 New Englad公司。AFLP分析所用接頭和引物由捷瑞公司合成，相關(guān)信息如下。

Ase I接頭序列：5'-TAGGTACGCAGTCTAC-3'；5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'；Ase I預(yù)擴(kuò)增引物序列：5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3'；Ase I選擇性擴(kuò)增引物序列：5'-GACTGCGTACCTAATNNN-3'，N為A、T、C、G堿基的任意一種。Taq I接頭序列：5'-GACGATGAGTCCTGAC-3'；5'-CGGTCAGGACTCAT-3'；Taq I預(yù)擴(kuò)增引物序列：5'-GACGATGAGTCCTGACCGA-3'；Taq I選擇性擴(kuò)增引物序列：5'-GATGAGTCCTGACCGANNN-3'，N為A、T、C、G堿基的任意一種。

1.2 辣椒葉片總DNA的提取及酶切反應(yīng)

利用改良SDS法小量提取F2代耐熱及熱敏辣椒植株葉片的總DNA，對(duì)所提取的總DNA分別進(jìn)行抽提純化和電泳檢測(cè)。

利用限制性內(nèi)切酶Taq I和Ase I對(duì)總DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物回收純化后備用。

1.3 接頭退火及連接反應(yīng)

Ase I接頭和Taq I接頭退火，然后與DNA雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.4 AFLP分析

①預(yù)擴(kuò)增反應(yīng) 分別以所有樣品的連接產(chǎn)物為模板，用與Taq I接頭、Ase I接頭匹配的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序是94℃5 min、94℃80s、52℃60s、72℃90 s，20個(gè)循環(huán)；72℃10min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物按需要進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋備用。

②選擇性擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋成5倍、10倍、15倍和20倍的工作用液，篩選合適的擴(kuò)增模板濃度。利用選擇性擴(kuò)增引物對(duì)A11、B22雜交F2代辣椒植株進(jìn)行AFLP分析，94℃3 min；94℃80 s，65℃60 s，72℃90 s，每循環(huán)退火溫度下降0.7℃，反應(yīng)12個(gè)循環(huán)；然后94℃3 min；94℃80 s，56℃60 s，72℃90 s，23個(gè)循環(huán)；延伸72℃10 min。

③電泳檢測(cè) 配制6%丙烯酰胺變性凝膠，電泳及銀染參照王關(guān)林等[7]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒葉片總DNA的提取

用SDS法從辣椒葉片中提取的總DNA的OD260/OD280比值在1.8左右，在1%的瓊脂糖凝膠中樣品帶清楚、凝膠背景清晰（圖1），經(jīng)過(guò)RNase A處理和酚/氯仿抽提后適用于酶切、連接等試驗(yàn)。

2.2AFLP反應(yīng)體系的建立

在預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)中，進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)濃度的大小稀釋10～20倍后用作AFLP預(yù)擴(kuò)增的模板，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增條件優(yōu)化研究。結(jié)果表明，以連接產(chǎn)物的10倍稀釋液為模板，擴(kuò)增20循環(huán)的效果最好，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在100～750 bp（圖2）。

選擇性擴(kuò)增以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15倍為模板，擴(kuò)增約35個(gè)循環(huán)效果較好（包括降落PCR部分）。循環(huán)數(shù)少，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低，在變性聚丙烯酰胺凝膠中條帶顏色較淺，通過(guò)延長(zhǎng)顯色時(shí)間可以增加條帶的清晰度，但是也導(dǎo)致了凝膠背景增加；循環(huán)數(shù)過(guò)多時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度過(guò)高和非特異條帶增多，變性凝膠中模糊的弱條帶增多，重復(fù)效果不穩(wěn)定。

圖1 SDS法提取辣椒葉片的總DNA 1～15表示辣椒葉片總DNA。

圖2 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

圖3 辣椒耐熱性狀相關(guān)基因的AFLP分析

2.3 辣椒耐熱基因的AFLP分析

本研究利用123對(duì)引物組合對(duì)辣椒耐熱、熱敏基因池進(jìn)行了引物篩選，從中選擇6對(duì)多態(tài)性較好的引物組合對(duì)辣椒F2代植株進(jìn)行AFLP分析。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結(jié)果顯示，每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶多數(shù)在30～70條，獲得11 400條穩(wěn)定、清晰條帶。其中A8T19和A12T15引物組合的擴(kuò)增結(jié)果中，耐熱辣椒品種中分別出現(xiàn)1條穩(wěn)定的差異條帶，推斷該差異條帶與辣椒耐熱性狀相關(guān)，至于確切關(guān)系還有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

AFLP分析多態(tài)性豐富、靈敏度高、重復(fù)性好[8，9]，在植物分子標(biāo)記研究中應(yīng)用廣泛，但DNA模板的質(zhì)量高低及銀染操作水平均對(duì)其分析結(jié)果產(chǎn)生重要影響，尤其在銀染中無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）質(zhì)量、漂洗操作及顯色時(shí)間的控制對(duì)條帶的清晰度和凝膠的背景的影響尤為突出[10]。

辣椒材料的高溫脅迫試驗(yàn)結(jié)果的判定對(duì)利用AFLP技術(shù)分析辣椒耐熱性狀相關(guān)基因的結(jié)果有十分重要的影響。本研究的高溫脅迫試驗(yàn)中，在42℃、相對(duì)濕度75%的條件下保持一定時(shí)間后，根據(jù)辣椒植株的形態(tài)特征去判定F2代植株的耐熱性，主觀的判定標(biāo)準(zhǔn)會(huì)對(duì)AFLP分析結(jié)果產(chǎn)生影響；如能結(jié)合分析高溫脅迫下辣椒的生理生化指標(biāo)，可以提高判定F2代植株的耐熱、熱敏性的準(zhǔn)確性[11]。在AFLP分析中耐熱、熱敏辣椒材料之間的差異條帶是否與耐熱性狀相關(guān)或連鎖還需要進(jìn)一步的回收克隆及進(jìn)行功能分析來(lái)加以確定。

[1]顧曉慧.與辣椒抗根結(jié)線蟲N基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記的開發(fā)[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[2]金新文，沈征言.高溫脅迫下三種蔬菜抗熱性不同的品種間葉片蒸騰強(qiáng)度作用的比較[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1997，1（3）：195-198.

[3]姚元干，石雪暉，楊建國(guó)，等.辣椒葉片耐熱性生理生化指標(biāo)探討[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24（2）：119-122.

[4]賈志銀，鞏振輝，許紅娟，等.高溫脅迫對(duì)辣椒幼苗生長(zhǎng)及生理性狀的影響[J].北方園藝，2010（12）：5-8.

[5]姚元干，石雪暉，楊建國(guó)，等.辣椒耐熱性與葉片質(zhì)膜透性及幾種生化物質(zhì)含量的關(guān)系 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26（2）：97-99.

[6]徐小萬(wàn)，雷建軍，羅少波，等.高溫高濕對(duì)現(xiàn)蕾期辣椒不同品種抗氧化性差異研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24（2）：394-400.

[7]王關(guān)林，張宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[8]Kehoe D M,Villand P,Omerille S.DNA microarrays for studies of higher plants and other photosynthetic organisms [J].Trends plant sci.,1999,4（1）：38-41.

[9]Diachenko L B,Ledesma J,Chenchik A A,et al.Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,219（3）：824-828.

[10]魏源文，鄧智年，黃誠(chéng)梅，等.乙烯利調(diào)控甘蔗基因的差異表達(dá)研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（1）：6-10.

[11]何鐵光，董文斌，王愛(ài)勤，等.高溫脅迫下辣椒生理生化響應(yīng)機(jī)理初步探討[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（2）：541-544.

Identification of AFLP Markers Linked to Heat-resistant Genes in Hot Pepper

HE Tieguang1,2,WEI Yuanwen3,GONG Mingxia1,DENG Zhinian3, DONG Wenbin1,ZHANG Chaoming1,ZHAO Kun1

A hybridization between hot pepper heat-resistant inbred line A11 and thermosensitive inbred line B22 was made for mapping heat-resistant gene(s),and the heat resistance of their F2segregation populations was identified through high temperature stress test.With six Taq I/Ase I primers with high polymorphism screened from 123 primer combinations, AFLP(amplified fragment length polymorphism)analysis was performed on resistant and thermosensitive F2plants.A total of about 11 400 distinguishable bands were amplified,of which two were stable difference.Two AFLP markers relevant to heat resistance of hot pepper were obtained preliminarily.The research not only helped to improve the breeding efficiency and level of hot pepper by using marker-assisted selection of heat-resistant genes,but also laid the foundation for the separation and cloning of related heat-resistant functional genes of hot pepper.

Hot pepper;Heat-resistant genes;AFLP analysis

Q785；S641.3

：A

：1001-3547（2014）04-0024-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.04.010

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011GXNSFA018106）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（桂科合：1140010-7）；南寧市興寧區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（2010028）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目 （桂農(nóng)科2011YM11）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目[201003（轉(zhuǎn)）]

何鐵光（1976-），男，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種與栽培及環(huán)境生態(tài)研究，電話：13978684761，

E-mail：tghe118@163.com

2013-07-16