復(fù)合酶法提取黃秋葵嫩果多酚的工藝優(yōu)化

汪殿蓓，李建華

特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北工程學(xué)院，孝感 432000

黃秋葵(Abelmoschus moschatus L.)是錦葵科一年生的草本植物，原產(chǎn)于非洲，果為蒴果，先端細(xì)尖略彎曲，形似羊角，又稱羊角豆。黃秋葵果實(shí)是一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值和顯著保健功能的新型保健蔬菜［1］，黃秋葵嫩果中蛋白質(zhì)、總糖、多糖含量豐富［1，2］，研究表明適量攝入黃秋葵果實(shí)粉能顯著提高衰老小鼠的免疫功能和抗疲勞能力［3］，說明黃秋葵嫩果中生物活性成分豐富。目前對黃秋葵嫩果中多糖［4］、果膠［5］等成分的提取工藝均有研究報(bào)道，但黃秋葵嫩果中多酚的提取工藝還未見報(bào)道。

植物多酚又稱植物單寧，是植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抑制酶活性、抑菌、抗致突變、消炎、降血壓等多種生物活性，主要存在于植物體的表皮、根、葉、殼和果肉中［6-8］。多酚在食品及其他領(lǐng)域有著廣泛的用途，從植物多酚中篩選功能食品或藥品成分是近年研究的熱點(diǎn)。本文以纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶構(gòu)成復(fù)合酶，采用復(fù)合酶法對黃秋葵嫩果中多酚提取工藝進(jìn)行探討，以期更進(jìn)一步促進(jìn)黃秋葵的開發(fā)與利用。采用酶法提取植物活性成分具有操作效率高、條件溫和、無污染的特點(diǎn)［9］。

1 材料與儀器

2012 年4 月將黃秋葵種子播于湖北工程學(xué)院苗圃內(nèi)，7 月份采摘嫩果，冷凍保存?zhèn)溆谩]食子酸溶液、Folin-Ciocalteau 試劑(FC 試劑，自制，磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色體系)、蒸餾水、碳酸鈉溶液(分析純)、纖維素酶(寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)、甘露聚糖酶(寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)、果膠酶(湖州禮來生物技術(shù)有限公司)。

202-2 型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);PL203型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);H-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);Cary 60 紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫科技(中國)有限公司);康佳BCD-138UTS 冰箱(安徽康佳電器有限公司);ZWL-08B 臺式離心機(jī)(金壇市鴻科儀器廠);康麗SO200-A 多功能攪拌機(jī)(順德市寶鋒電器廠);100～1000 μL 微量移液器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 最大吸收波長的檢測

將1.0 mL 50 μg/mL 沒食子酸溶液加入1.0 mL FC 試劑(1 ∶1)，然后加入3.0 mL 7.5%Na2CO3，蒸餾水定容至10.0 mL。20 ℃避光靜置l h，在分光光度計(jì)下進(jìn)行500～900 nm 掃描，確定最大吸收波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照鄧義書等［8］的方法，測定并繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1.0 mL 提取液于10.0 mL 試管中，加水3.0 mL，加0.2 mL FC 試劑，混勻，在30 sec 至8min 內(nèi)加入0.6 mL 7.5% Na2CO3溶液，混勻，定容至10.0 mL，于45 ℃保溫40 min，在測定的最大吸收波長下比色，每樣重復(fù)測量3 次，取平均值。

2.3 三種酶單獨(dú)使用時(shí)的最佳用量

酶發(fā)揮催化作用需要適當(dāng)溫度和pH 值條件，考慮到多酚在高溫下容易氧化分解，調(diào)整pH 值會加入其它物質(zhì)，在后續(xù)分離純化中不易去凈，本研究選取酶反應(yīng)溫度為40 ℃，自然pH 值(約為6.0)。

取45 只燒杯，分別加入1.00 g 黃秋葵嫩果粉末后，再分別加入30.0 mL 質(zhì)量百分比為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的纖維素酶(C1～C5)、甘露聚糖酶(H1～H5)和果膠酶(M1～M5)，自然pH值，置于40 ℃恒溫?fù)u床中，200 rpm 提取1 h，迅速冷卻至室溫過濾，測定多酚含量(n=3)，據(jù)此確定纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶單獨(dú)使用時(shí)的最佳用量。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黃秋葵嫩果去雜后均漿，均質(zhì)狀態(tài)下稱取3.00 g 置于50.0 mL 的試管中，加純水27.0 mL，45 ℃提取2 h，離心，取上清液按上述方法測定黃秋葵多酚提取量。在30.0 mL 提取體系中，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的正交試驗(yàn)，選用正交表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)，確定纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶這三種酶的最佳組合比例(用量)。

2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化復(fù)合酶提取工藝

在復(fù)合酶提取法中，提取時(shí)間、液料比以及提取溫度對多酚的提取有較大的影響。在正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶用量的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 軟件中的中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)模塊，設(shè)計(jì)了一組3 因素3 水平的實(shí)驗(yàn)(full CCD 設(shè)計(jì))，以確定提取時(shí)間、液料比以及提取溫度對黃秋葵多酚提取的影響(表1)。

準(zhǔn)確稱取1.00 g 黃秋葵嫩果粉末，按照中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中設(shè)置的不同提取條件分別進(jìn)行浸提，離心收集各個提取條件下得到的提取液，測定其多酚含量。每個處理重復(fù)3 次。

表1 試驗(yàn)的因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 軟件進(jìn)行多元回歸及方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多酚(以沒食子酸表示)在可見光區(qū)有一明顯的吸收峰，儀器隨機(jī)軟件顯示，波峰所在波長為768 nm。

3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值y 與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x，mg/mL)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.015x+0.061，決定系數(shù)R2值為0.9950，表明沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖1 三種酶在不同濃度下的多酚提取量Fig.1 Concentrations of polyphenols extracted by three enzymes at five concentrations

3.3 三種酶的最佳反應(yīng)濃度

在不同濃度的纖維素酶(C1～C5)、甘露聚糖酶(H1～H5)和果膠酶(M1～M5)作用下，黃秋葵多酚含量如圖1，結(jié)果顯示，三種酶在濃度C3、H3、M3，即質(zhì)量百分比為1.0%、濃度為10.0 mg/g 時(shí)提取的多酚含量最高。

3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

在30.0 mL 提取體系中，以三種酶單獨(dú)作用時(shí)的最佳量即濃度1.0%(10.00 mg/g)為基準(zhǔn)，設(shè)置3個水平—1.0%、2.0%、3.0%進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶的最佳組合為C2H3M1，即每g 提取體系中加纖維素酶0.0050 萬單位，甘露聚糖酶0.0075 萬單位，果膠酶0.0025 萬單位。

表2 正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and test results of orthogonal experiments

3.5 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果

以提取溫度、液料比和提取時(shí)間為變量，用響應(yīng)曲面法分析由2.0%纖維素酶、3%甘露聚糖酶和1%果膠酶組成的多酶復(fù)合體提取黃秋葵嫩果多酚的最佳工藝條件。以每克黃秋葵嫩果中總多酚提取量為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface analysis

3.6 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design expert 軟件對表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黃秋葵嫩果多酚提取量對提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、和液料比(C)的三次多項(xiàng)回歸方程:

對所得模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。從表4 可以看出，該回歸模型P＜0.01，表明回歸方程模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.966 ＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9930，為0.9814，說明模型回歸方程的擬合程度良好，可用來分析和預(yù)測黃秋葵多酚的提取工藝。

從表4 的方差分析可知，回歸模型的一次項(xiàng)中A(溫度)、B(液料比)差異極顯著，二次項(xiàng)中AC 項(xiàng)差異顯著，BC、A2、B2、C2差異極顯著，三次項(xiàng)中A2B、A2C 差異極顯著，C(時(shí)間)項(xiàng)差異不顯著，這表明不同的提取因素與黃秋葵多酚提取量不是簡單的線性關(guān)系。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitted cubic polynomial model

注:＊＊差異極顯著，* 差異顯著。Note:＊＊ indicated very significant difference，* indicated significant difference.

3.7 響應(yīng)曲面分析與工藝優(yōu)化

根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)曲面圖，以確定提取溫度、提取時(shí)間和液料比三個因素對黃秋葵多酚提取效果的影響及這三個因素間的相互作用，響應(yīng)曲面圖如圖2 和圖3。提取溫度與液料比之間交互作用不顯著。

圖2 提取溫度和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot of cross-interaction between extraction temperature and time on extraction yield of polyphenol from okra

圖3 液料比和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface plot of cross-interaction between liquid-solid ratio and extraction time on extraction yield of polyphenol from okra

響應(yīng)面可以直接反應(yīng)出各因子對響應(yīng)值影響的大小，響應(yīng)曲面法的圖形是響應(yīng)值Y 對應(yīng)自變量A、B、C 構(gòu)成的一個三維空間圖，從響應(yīng)面分析圖上可以看出其在反應(yīng)過程中的相互作用而確定合適的工藝條件［10］。如果響應(yīng)面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響到響應(yīng)值的大小。相反，如果坡度非常陡峭，那么表明響應(yīng)值對于處理?xiàng)l件改變非常敏感。由圖2 和圖3 可以看出，提取溫度和液料比對黃秋葵多酚提取具有極顯著影響，提取溫度與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間的兩兩交互作用顯著，提取溫度與提取時(shí)間、提取時(shí)間與液料比三次方項(xiàng)之間存在著顯著的交互作用。

根據(jù)響應(yīng)曲面優(yōu)化的結(jié)果，黃秋葵嫩果多酚提取優(yōu)化工藝條件為:提取溫度44.97 ℃，液料比(mL∶g)58.80∶1，提取時(shí)間3.99 h，預(yù)測多酚提取值為29.193 mg/g。

3.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對響應(yīng)曲面法獲得的優(yōu)化工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，鑒于實(shí)際操作的可行性，提取工藝條件改為提取溫度45 ℃，液料比(mL∶g)60∶1，提取時(shí)間4 h，實(shí)驗(yàn)測得黃秋葵嫩果多酚含量為29.156 mg/g，與預(yù)測值非常接近，說明通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化的黃秋葵多酚提取工藝具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，是有效可行的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，獲得2.0%纖維素酶、3.0%甘露聚糖酶和1.0%果膠酶的多酶復(fù)合體;應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法對復(fù)合酶法黃秋葵嫩果多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到黃秋葵嫩果多酚提取量對提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、和液料比(C)的三次多項(xiàng)回歸方程:Y=-610.496 +34.129 A -1.604 B +239.13 C -12.988 AC +0.109 BC -0.419 A2+0.013 B2+1.845 C2-0.000024 A2B+0.164 A2C，該模型具有良好的預(yù)測效果。

根據(jù)回歸分析結(jié)果得到復(fù)合酶法提取黃秋葵嫩果多酚的優(yōu)化工藝為:提取溫度44.97 ℃，液料比(mL∶g)58.80∶1，提取時(shí)間3.99 h，預(yù)測多酚提取值為29.193 mg/g。通過實(shí)踐驗(yàn)證，該工藝條件有效可行，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。復(fù)合酶法提取植物活性成分，具有無污染、條件溫和、抽取效率高的特點(diǎn)，而且本試驗(yàn)中復(fù)合酶采用水溶解，兼顧了食品安全，因此該工藝可為黃秋葵多酚的批量生產(chǎn)提供參考。

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