響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取熟地黃多糖的工藝研究

施偉梅 ，張賽男 ，陳建福 ，詹 思 ，吳龍火 *

（1.贛南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，江西 贛州 341000；2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取熟地黃多糖的工藝研究

施偉梅1，張賽男1，陳建福2，詹 思1，吳龍火1*

（1.贛南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，江西 贛州 341000；2.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000）

為優(yōu)化纖維素酶法輔助提取熟地黃中多糖的提取方法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取pH、酶解溫度、提取時間、酶用量為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，采用中心組合（Box-Behnken）試驗設(shè)計方法，研究各自變量及其交互作用對多糖得率的影響.采用Design-Expert軟件，建立多糖得率與提取過程中各因素的二次多項式模型，并通過響應(yīng)面優(yōu)化法確定在pH為6的條件下熟地黃多糖提取最佳工藝為：酶解溫度57℃、酶解時間 2 h、酶用量1.8%，在此修正條件下，提取多糖的預(yù)測值為7.05%.經(jīng)過試驗驗證，熟地黃多糖的得率為7.18%，與預(yù)測值的相對誤差為1.84%，驗證了數(shù)學(xué)模型的有效性.

熟地黃；多糖；響應(yīng)面法；纖維素酶輔助提取

0 引言

熟地黃（Radix Rehmanniae Preparata）又名熟地，為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊莖經(jīng)加工炮制而成[1-2]，具有益精填髓、滋陰補血、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、提高記憶力、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理作用，可應(yīng)用于目昏耳鳴、腰膝酸軟、肝腎陰虛、月經(jīng)不調(diào)、骨蒸潮熱、崩漏下血、心悸怔忡等癥狀[3-6].熟地黃多糖是熟地黃中特有的活性成分之一，藥理研究表明，熟地黃多糖有增強免疫力、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、補血等生理功能[7].近年來，有關(guān)熟地黃多糖的提取工藝[8-9]已有報道，而關(guān)于利用纖維素酶輔助提取熟地黃多糖的提取工藝卻鮮見報道，纖維素酶能有效破壞植物組織細胞，降低植物顆粒到溶劑中的阻力，促進多糖物質(zhì)的溶出，具有能耗低、環(huán)境污染小、易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點[10-13]，在天然功能性產(chǎn)物提取中受到越來越廣泛的重視.為此，本研究以熟地黃多糖得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其纖維素酶法輔助提取工藝，為熟地黃資源的深加工及熟地黃多糖功能性食品、保健品的開發(fā)提供新的有效途徑.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

熟地黃：贛州市章貢區(qū)藥房，在60℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量后粉碎，過60目篩，置于干燥皿中密封保存?zhèn)溆茫黄咸烟菍φ掌罚褐袊幤飞镏破窓z定所；纖維素酶（30 000 U/g）：江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司；其他試劑均為分析純.

Lambda35紫外可見分光光度計：美國珀金埃爾默公司；DHG-9070電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDL-50B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；Q-250B高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司；AB135-S電子分析天平：上海樹信儀器儀表有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準曲線的建立

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準樣品繪制標(biāo)準曲線.稱取葡萄糖1 g用蒸餾水溶解，并定容于100 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準溶液備用.吸取10 mg/mL葡萄糖標(biāo)準溶液 0.5、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，分別用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，再分別取0.2 mL溶液于6個干燥比色管中，向各管中分別加入0.5 mL 5%苯酚、2.5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置20 min，以不加標(biāo)準溶液的相應(yīng)溶液作空白，在波長490 nm處分別測定吸光度并繪制葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準曲線.所得回歸曲線方程為：y=6.460 2 x-0.158 2，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 2，其中y為提取液的吸光度，x為提取液中多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）.結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.05～0.18 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A之間有良好的線性關(guān)系.

1.2.2 熟地黃多糖的提取工藝

熟地黃→烘干→粉碎→稱量→95%乙醇脫單糖、低聚糖→揮干溶媒后稱量→加水→調(diào)節(jié)pH→加纖維素酶→水浴→80℃滅酶30 min→脫蛋白→醇沉→抽濾→重溶于水→離心→測定吸光度.

1.2.3 校正因子的測定

準確稱取經(jīng)處理的熟地黃粉末1 g，用95%乙醇80 mL在100℃條件下回流1 h，所得藥渣揮干溶劑后，在料液比1∶30條件下加水浸泡0.5 h，調(diào)pH為6.0，加入質(zhì)量分數(shù)為2%的纖維素酶，于55℃下反應(yīng)2 h，提取熟地黃中的多糖，提取結(jié)束后，于80℃的條件下滅酶30 min，脫蛋白后得多糖提取液，醇沉、抽濾，用95%乙醇多次洗滌，烘干，得多糖，稱量后溶解于50 mL水中，以3 500 r/min離心 5 min，取0.4 mL提取液，按一定比例稀釋，根據(jù)標(biāo)準曲線的測定方法，于490 nm下測定其吸光度，其吸光度為0.563 7，校正因子F計算公式為：

式中:W為所稱取多糖的質(zhì)量，mg；A為所測多糖溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；B為稀釋因素，mL.

經(jīng)計算得F=0.51.

式中:C為稀釋后多糖提取液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；D為提取液的稀釋因素，mL；F為校正因子，即0.51；M為稱取的熟地黃的質(zhì)量，mg.

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗

采用單因素試驗研究pH、提取溫度、提取時間和酶量對提取熟地黃多糖的影響.

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對熟地黃多糖的提取工藝進行優(yōu)化，通過擬合二次多項式的方程，計算出最佳工藝組合及在此條件下多糖的最大得率理論值.

應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件采用Box-Behnken Design（BBD）進行試驗設(shè)計.以提取溫度（X1）、提取時間（X2）及酶量（X3）為自變量，熟地黃多糖得率為指標(biāo)，進行響應(yīng)曲面分析.響應(yīng)曲面因素與水平見表1.

表1 響應(yīng)曲面因素與水平

1.3.3 驗證與比較試驗

通過軟件分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進行提取測定，比較試驗結(jié)果和方程計算值的差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對熟地黃多糖得率的影響

固定料液比1∶30、提取溫度55℃、提取時間1 h、酶量1%，考察不同pH對多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 pH對多糖得率的影響

從圖1可以看出，隨著pH的增大，熟地黃多糖的得率迅速上升，當(dāng)pH 6時，多糖得率達到最大，但當(dāng)pH繼續(xù)增大時，多糖得率反而降低.這是因為在適當(dāng)?shù)?pH條件下，靜電作用可以維持酶活性中心的最佳三維構(gòu)象，促進酶和底物的結(jié)合，酶催化的反應(yīng)速率達到最大，得率相應(yīng)也較高；而pH值發(fā)生改變，會使酶與底物所帶電荷不同，酶的立體構(gòu)象以及酶與底物的親和力不同，催化速度也就不同.因此，最適宜pH應(yīng)為6.

2.1.2 提取溫度對熟地黃多糖得率的影響

固定料液比 1∶30、pH 6.0、提取時間 1 h，、酶量1%，考察不同溫度對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 提取溫度對多糖得率的影響

從圖2可以看出，隨著提取溫度升高，熟地黃多糖的得率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為55℃時，多糖得率達到最大，溫度繼續(xù)升高，熟地黃多糖得率則逐漸減小.這是因為酶是一類具有最適反應(yīng)溫度范圍的物質(zhì)，在較低溫度時升溫可以提高酶的活性，而溫度過高則會導(dǎo)致酶受熱變性而失活.因此最佳提取溫度應(yīng)控制在55℃左右.

2.1.3 提取時間對熟地黃多糖得率的影響

固定料液比1∶30、調(diào)pH 6.0、提取溫度55℃、酶量1%，考察不同提取時間對多糖得率的影響，結(jié)果見圖3.

圖3 提取時間對多糖得率的影響

從圖3可以看出，熟地黃多糖的得率隨著提取時間的延長而迅速增大，當(dāng)提取時間為2 h時，熟地黃多糖得率達到最大，再繼續(xù)延長提取時間，熟地黃多糖得率則有所下降.這是因為隨著反應(yīng)時間延長，酶解越充分，多糖含量也就越高.而當(dāng)酶量達一定值時，酶促反應(yīng)時間的延長并不能使得率增加，甚至?xí)沟寐氏陆?，這可能是由于提取時間太長會引起糖結(jié)構(gòu)變化甚至使碳環(huán)裂解，導(dǎo)致多糖含量降低.因此適宜提取時間為2 h.

2.1.4 酶量對熟地黃多糖得率的影響

纖維素酶可以降解纖維素等多糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)的水解會導(dǎo)致細胞壁的部分破損、細胞膜通透性增加，促使多糖類化合物的釋放.固定料液比1∶30、調(diào) pH 6.0、提取溫度 55 ℃、提取時間 2 h，考察不同酶量對多糖得率的影響，結(jié)果見圖4.

圖4 酶量對多糖得率的影響

從圖4可以看出，當(dāng)酶量較小時隨著酶量增大，熟地黃與纖維素酶接觸機會增大，破壁效果增加，多糖得率也不斷增大，當(dāng)酶量為2%時，多糖得率達到最大，酶量繼續(xù)增大，熟地黃多糖得率開始下降.可能是因為當(dāng)酶量達到一定程度時，多糖的纖維降解物大量存在，使得多糖的溶解變得困難.因此最佳酶量選擇為2%.

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素的基礎(chǔ)上采用3因素3水平試驗設(shè)計，選取對熟地黃多糖得率影響較大的因素：提取溫度（X1）、提取時間（X2）、酶量（X3）進行優(yōu)化試驗，并固定料液比為1∶30、pH值為6，因素和水平設(shè)計見表2，響應(yīng)面分析方案見表3.

表2 響應(yīng)曲面試驗以及響應(yīng)值

表3 方差分析

從表3可知，該模型極顯著.由模型擬合得到的回歸方程為：R1=-36.474 9+1.145 4X1+5.961 6X2+4.679 0X3+9.690 0E-003X1X2+0.023 97 X1X3-0.040 80X2X3-0.010-1.503-1.615 7.該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.998 9，調(diào)整系數(shù)=0.997 5，說明該模型的擬合程度較好，試驗誤差小，因此該回歸方程模型成立，方程中P＜0.05的項代表顯著項，包括 X1、X2、X3及二次項 X1X3、、、.方程的失擬項其F值為3.00，失擬項P=0.158 0＞0.05，失擬項不顯著，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以用其確定最佳提取工藝條件.由此得到的最佳工藝條件為：提取時間 2.14 h、提取溫度57.10℃、酶量1.84%，在此修正條件下，多糖得率最大預(yù)測值為 7.05%.

2.2.2 試驗因素交互作用對響應(yīng)值影響的3D分析

各試驗因素交互作用對響應(yīng)值影響的3D分析結(jié)果及等高面見圖5.各因素及其相互作用對響應(yīng)值的影響可以通過各圖直觀反映出來.由圖5可知，主次因素順序為酶量＞提取溫度＞提取時間.

圖5 提取溫度、提取時間和酶量交互作用對多糖得率R1影響的相應(yīng)曲面（3D）及等高曲線

2.2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗證

為檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃裕捎米顑?yōu)提取條件進行熟地黃的提取試驗，但考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：提取溫度57℃，提取時間2 h，酶量1.8%，在此條件下進行3次平行試驗，實際得率為7.18%，相對于預(yù)測值，誤差為1.84%，與Design-Expert軟件的預(yù)測值基本一致.因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)可靠，得到的多糖提取條件具有實際應(yīng)用價值.

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶法輔助提取熟地黃多糖的工藝，建立了熟地黃多糖得率與提取過程中的關(guān)鍵因素（提取溫度、提取時間和纖維素酶用量）之間的二次多項式回歸模型，經(jīng)檢驗該模型合理可靠，同時利用該模型對熟地黃多糖纖維素酶輔助提取過程中的關(guān)鍵因素進行單因素及交互效應(yīng)分析，得出熟地黃多糖纖維素酶輔助提取關(guān)鍵因素的優(yōu)化條件為：酶解時間 2.14 h、酶解溫度57.10℃、酶用量1.84%，在此修正條件下，多糖得率最大預(yù)測值為7.05%.考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：提取溫度57℃，提取時間2 h，酶量1.84%，在此條件下進行3次平行試驗，實際得率為7.18%，驗證了數(shù)學(xué)模型的有效性.響應(yīng)面分析法對熟地黃多糖提取條件的優(yōu)化是合理可行的，該方法為提高熟地黃多糖的得率及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持.

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OPTIMIZATION OF CELLULOSE-ASSISTED EXTRACTION OF POLYSACCHARIDES FROM RADIX REHMANNIA PREPARATA USING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY

SHIWei-mei1， ZHANG Sai-nan1， CHEN Jian-fu2， ZHAN Si1， WU Long-huo1
(1.College of Pharmacy， Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China； 2.Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products，Higher Education Institutions In Fujian Province， Zhangzhou Institute of Technology， Zhangzhou 363000， China)

In order to optim ize the cellulose-assisted extraction of polysaccharides from Radix Rehmannia Preparata， we designed Box-Behnken central composite experiments by selecting pH value， extraction temperature，extraction time and cellulose amount as independent variables and selecting polysaccharide yield as response value to study the effects of each variable and their interaction effect.We constructed a quadratic multinomialmodel between the polysaccharide yield and each variable in the extraction process by Design-Expert software，and determ ined the optimum polysaccharide extraction conditions by response surface methodology when the pH value was kept at 6.The results showed that the optimum conditions were as follows:extraction temperature 57 ℃，extraction time 2 h，cellulose amount 1.8%；and the predictive value of the polysaccharide yield was 7.05% under the modified conditions.The experimental verification results showed that the polysaccharide yield of Radix Rehmannia preparata reached 7.18%，and has a 1.84%relative error in comparison w ith the predictive value，so that themathematicalmodel was effective.

Radix Rehmannia Preparata；polysaccharides；response surface methodology；cellulose-assisted extraction

TS218；R284.2；O636

B

1673-2383(2014)05-0023-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20141029.1723.005.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-10-29 17:23:36

2014-05-09

國家自然科學(xué)基金（81360277）

施偉梅（1985-），女，福建東山人，講師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物成分與活性.

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