結(jié)合換算因子的苯酚-硫酸法測(cè)定紅茶菌培養(yǎng)液中水溶性多糖含量的研究

范海濤 ，張虎成，曲 偉，王孟君，，劉欣欣，王鵬飛

1北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100029;2 北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100012;3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100027

紅茶菌(Kombucha)又名海寶或胃寶，在我國(guó)民間很早就有培養(yǎng)和流傳，并作為一種日常飲用的傳統(tǒng)飲料。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的研究表明，紅茶菌對(duì)多種慢性疾病，如高血壓、冠心病、糖尿病等具有一定的療效［1］，由于紅茶菌的培養(yǎng)屬于共生菌的混合發(fā)酵過(guò)程，故培養(yǎng)液成分復(fù)雜，目前認(rèn)為多種成分決定了紅茶菌培養(yǎng)液的活性。文獻(xiàn)報(bào)道［2，3］，紅茶菌培養(yǎng)液中含有較多的多糖類物質(zhì)，并可能與香菇、靈芝和茯苓等真菌多糖類似，具有藥物活性。本課題組前期初步活性研究表明，紅茶菌多糖(Kombucha Polysaccharides，KPS)具有清除自由基的活性，與其他許多多糖活性相仿。

對(duì)紅茶菌多糖含量的測(cè)定已有相關(guān)報(bào)道，如:程江峰［4］以苯酚-硫酸法對(duì)紅茶菌多糖進(jìn)行了含量測(cè)定，初步確定了測(cè)定條件。但是不同單糖與苯酚-硫酸試劑顯色情況不同，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率也不同，甚至有些糖差別很大［5］，因此單純用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算多糖含量必然會(huì)存在較大誤差。為了開(kāi)發(fā)利用紅茶菌多糖，需建立一種比經(jīng)典方法更可行和準(zhǔn)確的多糖部位中糖含量的測(cè)定方法。對(duì)于雜多糖，分析結(jié)果必須根據(jù)各單糖的組成比及各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正系數(shù)加以校正計(jì)算，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，操作比較繁瑣［6］。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，有學(xué)者采用測(cè)定換算因子的方法來(lái)消除單純以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線引起的誤差［7，8］，并用于植物來(lái)源多糖的含量測(cè)定。

紅茶菌培養(yǎng)液中多糖包括茶葉來(lái)源的植物多糖及發(fā)酵菌產(chǎn)生的細(xì)菌多糖和真菌多糖，其單糖組成及連接方式等相對(duì)較復(fù)雜，對(duì)苯酚-硫酸比色法進(jìn)行含量測(cè)定的影響因素較多。本研究以精制紅茶菌多糖測(cè)得紅茶菌多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，再以此校正采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定的紅茶菌粗多糖部位的多糖含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，確定測(cè)定紅茶菌多糖含量的快速、簡(jiǎn)便、可靠的方法。

1 儀器與試藥

UV-5800 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CARY50 全波長(zhǎng)紫外掃描儀，瓦里安公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph;電子天平，奧豪斯公司;高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;冷凍干燥機(jī)，天津因賽科技發(fā)展有限公司。

祁紅茶葉，購(gòu)于北京物美大賣場(chǎng)北苑店(產(chǎn)地福建省福安市福東茶廠);紅茶菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存;苯酚，為重蒸苯酚，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;過(guò)氧化氫、葡萄糖、氯化鈉、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純;濃硫酸為優(yōu)級(jí)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅茶菌的培養(yǎng)

稱取4 g 紅茶，以1000 mL 的沸水煮20 min，加入50 g 葡萄糖，煮10 min，放涼后濾去茶葉補(bǔ)足水至1000 mL 作為紅茶菌培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)后得到紅茶菌培養(yǎng)液。

2.2 紅茶菌多糖的提取與精制

培養(yǎng)10 d 后的紅茶菌培養(yǎng)液，棄去菌膜，取菌液460 mL 沸水提取30 min，冷卻后3000 rpm 離心，取上清，50 ℃減壓濃縮至小體積，冷卻至室溫后加入乙醇，至溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日棄上清，并將沉淀?yè)]干乙醇后以水溶解后再次離心，上清液再次以80%乙醇沉淀，4℃冰箱中過(guò)夜后棄上清，如此反復(fù)處理多次，直至目測(cè)多糖溶液無(wú)色，將多糖溶液以Sevag 法除蛋白多次，直至其在280 nm 處無(wú)明顯紫外吸收峰，除蛋白結(jié)束，濃縮水層得粗多糖溶液，冷凍干燥得紅茶菌粗多糖，為灰白色粉末51.8 mg，計(jì)算其得率為11.26 mg/100 mL。

將紅茶菌粗多糖先后用過(guò)氧化氫、透析處理，并以無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌8 次后真空冷凍干燥，即得紅茶菌精制多糖。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)該操作下的黑骨藤精制多糖進(jìn)行了驗(yàn)證，可保證多糖中基本不含其他雜質(zhì)［9］。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1 苯酚溶液的配制

稱取苯酚36 g，加入蒸餾水24 mL，即為60%的苯酚溶液，冰箱中密封避光長(zhǎng)期保存。

取密封避光保存的60%苯酚溶液，放置于室溫，精密移取5 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，即為6%的苯酚溶液，臨用前現(xiàn)配。

2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

精密稱定105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖50 mg，蒸餾水定容于50 mL 容量瓶中，搖勻，配制成濃度為1 g/L 的儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中分別精密移取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL 置于9個(gè)50 mL 容量瓶中，蒸餾水定容，配制成10、20、40、50、60、70、80、100、120 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1.0 mL，空白取1.0 mL 水，分別置于50 mL 容量瓶中，各加6%的苯酚1.0 mL 后充分振搖，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，振搖，室溫放置40 min 后于490 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度(C)對(duì)吸光度(A)進(jìn)行線性回歸，在10～100 mg/L 范圍內(nèi)得回歸方程C=131.58A -4.88，r=0.9997，葡萄糖對(duì)照品在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 紅茶菌精制多糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

按照2.3.2 方法，將紅茶菌精制多糖配制成40、50、60、70、80 和100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.3.5 紅茶菌精制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照2.3.3 方法，得紅茶菌精制多糖的回歸方程C=797.22A-6.26，r=0.9991，紅茶菌精制多糖在20～100 mg/L 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.4 換算因子的計(jì)算

根據(jù)苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量的原理，不同種類的糖與苯酚-硫酸試劑顯色情況不同，利用換算因子校正測(cè)定結(jié)果能夠較好地消除這個(gè)因素帶來(lái)的誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確。

精密稱定紅茶菌精制多糖20.3 mg，蒸餾水定容于50 mL 容量瓶中，配制成濃度為406 mg/L 的儲(chǔ)備液。從中取出5 mL 置于25 mL 的容量瓶中，蒸餾水定容，配制成81.2 mg/L 的待測(cè)溶液。精密移取精制多糖的待測(cè)溶液1.0 mL，按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中的多糖濃度，按f=W/(C ×D)計(jì)算換算因子，其中W 為樣品配制濃度(mg/L)，C 為通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖濃度(mg/L)，D 為樣品溶液稀釋的倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行稀釋，D=1，測(cè)得f=5.93(n=3)。

2.5 粗多糖溶液的配制

精密稱定紅茶菌粗多糖77.7 mg，定容于10 mL容量瓶中，從中精密移取2 mL，定容于50 mL 容量瓶中，配制成濃度為310.8 mg/L 的儲(chǔ)備液。從中取出10 mL 置于50 mL 的容量瓶中，定容，配制成62.2 mg/L 的待測(cè)溶液。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密移取紅茶菌粗多糖待測(cè)液1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，平行測(cè)定6 份，得吸光度平均值為0.103，RSD 為4.2%(n=6)，表明此方法精密度良好。

2.7 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取紅茶菌粗多糖待測(cè)液1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法分別于0、1、2、3、4 h 測(cè)定其吸光度，得吸光度平均值為0.108，RSD 為4.9%(n=5)。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取已知含量的紅茶菌粗多糖待測(cè)溶液1.0 mL 6 份，分別置于6 個(gè)25 mL 容量瓶中，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，按下式計(jì)算加樣回收率:R=［(M-P/f)/A］×100%，式中P 為加入的紅茶菌粗糖濃度62.1 mg/L;A 為葡萄糖加入量;M 為(A+P)藥量混合后進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)所得測(cè)定值經(jīng)換算后得到的總糖量;f 為紅茶菌多糖-葡萄糖的換算因子5.93。測(cè)得平均加樣回收率為101.40%，RSD 5.03%，見(jiàn)表1。

表1 紅茶菌多糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test of Kombucha polysaccharides

2.9 紅茶菌粗多糖含量測(cè)定

精密移取粗多糖待測(cè)溶液1.0 mL，按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中的多糖濃度。多糖含量=CDf/W ×100%，計(jì)算得紅茶菌粗多糖部位中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%(n=6)。按照實(shí)驗(yàn)2.2 中粗多糖收率，得紅茶菌培養(yǎng)液中多糖含量為9.79 mg/100 mL。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定苯酚-硫酸法結(jié)合換算因子測(cè)定紅茶菌培養(yǎng)液中多糖方法可行。

3 討論

苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量時(shí)，糖的種類對(duì)結(jié)果影響較大，且個(gè)別糖之間有較大差別，簡(jiǎn)單以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)不同來(lái)源的多糖進(jìn)行含量測(cè)定會(huì)使結(jié)果差異很大［10］，因此有必要采用換算因子法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正，使測(cè)定結(jié)果更加接近真實(shí)值。本研究首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算發(fā)現(xiàn)紅茶菌多糖-葡萄糖的換算因子為5.93。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)紅茶菌精制多糖進(jìn)行了進(jìn)一步分離，初步得到十一個(gè)多糖部位，對(duì)這些部位進(jìn)行換算因子的測(cè)定，也有差異，表明這些多糖部位的單糖組成的不同，反映了換算因子校正測(cè)定結(jié)果只能盡可能接近真實(shí)值，應(yīng)該針對(duì)具體的研究對(duì)象分別進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

近年來(lái)，對(duì)細(xì)菌及真菌來(lái)源的多糖逐漸清晰的藥理學(xué)研究，表明了其具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，紅茶菌多糖部位中多糖含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)紅茶菌多糖的進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和利用有現(xiàn)實(shí)意義，本文采用的方法操作簡(jiǎn)便、顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確度高，可作為紅茶菌多糖的含量測(cè)定方法。

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