中藥甘松中的白藜蘆醇低聚體類成分

王忠平，陳應(yīng)鵬，梁 爽，汪 娟，鄭紅紅，吳紅華*

1天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193;2天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457

甘松為敗醬科多年生草本植物甘松的干燥根及根莖，性辛、甘、溫，歸脾、胃經(jīng)，具有“理氣止痛，開郁醒脾;外用祛濕消腫”之功效，用于脘腹脹滿，食欲不振，嘔吐;外用治牙痛，腳氣腫毒等，現(xiàn)代藥理研究報道其具有抗心律失常、降血壓、舒張平滑肌、抗心肌缺血等作用，是穩(wěn)心顆粒等中藥制劑重要組成中藥之一。甘松的化學(xué)成分國內(nèi)外已有較多報道，主要含倍半萜、環(huán)烯醚萜、三萜等萜類成分。本研究擬通過甘松化學(xué)成分的系統(tǒng)分離與鑒定，為后期甘松藥材的質(zhì)量控制及相關(guān)中成藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供支持。采用硅膠、凝膠等柱色譜，以及高效液相制備色譜等現(xiàn)代分離方法，從甘松70%乙醇冷浸滲漉提取液的乙酸乙酯萃取部位中分離得到5 個白藜蘆醇低聚體類化合物，通過物理化學(xué)性質(zhì)和波譜學(xué)方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為:α-viniferin(1)、kobophenol A(2)、蛇葡萄素A(ampelopsin A，3)、isohopeaphenol(4)、grandiphenol A(5)?；衔?～5 均為首次從該屬植物中分離得到(圖1)。

圖1 化合物1～5 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 儀器與材料

BRUKER AV Ⅲ核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)，Agilent 1260 制備型液相色譜儀(美國Agilent 公司)，METTLER TOLEDO 萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵、DLSB-5/25 型低溫冷卻液循環(huán)泵、RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠)，TH-II型薄層加熱器(上海科哲生化科技有限公司)，ZF-20D 暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)，薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠(青島海洋化工廠)，反相C18柱層析硅膠ODS-A-HG(日本YMC 公司)，Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(瑞士GE Healthcare 公司)，D101 大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);所用試劑均為分析純。

本研究所用藥材購自河北安國藥材市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李天祥副教授鑒定為敗醬科甘松屬植物甘松Nardostachys chinensisBatal.的根及根莖，標(biāo)本存放于天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥新藥研發(fā)中心中藥化學(xué)與分析部(No.B20604126)。

2 提取與分離

甘松20 kg，8 倍量70%乙醇浸泡3 次，第1 次7 d，后2 次各3 d，合并提取液，減壓回流至無醇味，得浸膏約3 kg。藥渣用70%乙醇煮2 h，合并提取液，減壓回流至無醇味，得浸膏約400 g。合并兩次浸膏得總浸膏3.4 kg，加適量蒸餾水混懸，依次用石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得石油醚萃取物320 g、乙酸乙酯萃取物1130 g、正丁醇萃取物600 g。萃取后水層經(jīng)70%乙醇醇沉，所得上清液濃縮回收成浸膏并與正丁醇萃取物合并，再通過D101 大孔吸附樹脂柱乙醇-水梯度洗脫，得水洗脫部位950 g、30% 乙醇洗脫部位190 g、50%乙醇洗脫部位176 g、70%乙醇洗脫部位140 g、95%乙醇洗脫部位70 g。95%乙醇洗脫部位合并入乙酸乙酯萃取物得乙酸乙酯部位。

乙酸乙酯部位1.2 kg 經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度(100∶0～0∶100)洗脫，得15 個組分(Fr.A、B、C、……)。組分Fr.J(40 g)再經(jīng)硅膠柱色譜(乙酸乙酯等度洗脫)，得4 個組分(Fr.JA、JB、JC、JD)，其中組分Fr.JB(3.1 g)經(jīng)凝膠柱(甲醇洗脫)后，利用硅膠柱及制備高效液相色譜分離得到化合物1(60 mg)、2(84 mg)、3(10 mg)、4(5 mg)、5(50 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末(甲醇);C42H30O9，易溶于甲醇，UV 254 nm 顯暗斑，UV 365 nm 無熒光;10%硫酸乙醇溶液顯棕黃色。(+)-ESI-MSm/z679.4［M+H］+，(-)-ESI-MSm/z677.6［M-H］-。CD (c=0.0008，CH3OH)Δε:224 (14.1)，259 (-5.0)，278 (1.5)，302 (-4.6)。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:9.59 (2H，br s，4c/13c-OH)，9.56 (1H，br s，4b-OH)，9.47 (1H，br s，4a-OH)，9.45 (1H，br s，13b-OH)，9.42 (1H，br s，13a-OH)，7.20 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2c/6c)，7.00 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2b/6b)，6.92 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2a/6a)，6.73 (4H，d，J=8.6 Hz，H-3b/5b/3c/5c)，6.64 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3a/5a)，6.61 (1H，d，J=1.2 Hz，H-14b)，6.46 (1H，d，J=1.8 Hz，H-14c)，6.20 (1H，d，J=1.7 Hz，H-12b)，6.17 (1H，d，J=1.8 Hz，H-12c)，6.14 (1H，d，J=1.9 Hz，H-12a)，5.98 (1H，s，H-7a)，5.96 (1H，d，J=1.9 Hz，H-14a)，5.88 (1H，d，J=10.2 Hz，H-7c)，4.91 (1H，d，J=5.6 Hz，H-7b)，4.62 (1H，d，J=10.2 Hz，H-8c)，4.61 (1H，d，J=5.6 Hz，H-8b)，3.78 (1H，s，H-8a);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:160.6 (C-13c)，160.2 (C-11b/11c)，159.5 (C-11a)，158.9 (C-13b)，158.7 (C-13a)，158.0 (C-4b)，157.9 (C-4c)，157.4 (C-4a)，140.6 (C-9b)，139.0 (C-9a)，137.5 (C-9c)，131.1(C-1c)，130.6 (C-1a)，130.2 (C-1b)，128.2 (C-2b/6b/2c/6c)，127.7 (C-2a/6a)，119.7 (C-10b)，118.6 (C-10c)，118.0 (C-10a)，115.7 (C-3b/5b/3c/5c)，115.3 (C-3a/5a)，108.1 (C-14a)，105.6(C-14b)，105.2 (C-14c)，97.4 (C-12a)，96.5 (C-12c)，96.1 (C-12b)，94.7 (C-7b)，88.9 (C-7c)，85.6 (C-7a)，53.9 (C-8b)，51.2 (C-8c)，45.0 (C-8a)。2D-NMR 相關(guān)譜如圖2 所示。綜上所述，并參考文獻［1］報道的數(shù)據(jù)，鑒定化合物1 為α-viniferin。

圖2 化合物1 的HMBC 和NOESY 相關(guān)譜Fig.2 Key HMBC and NOESY correlations of compound 1

化合物2 褐色粉末(甲醇);C56H44O13，易溶于甲醇，UV 254 nm 顯暗斑，UV 365 nm 顯藍色熒光;10%硫酸乙醇溶液顯黃褐色。(+)-ESI-MSm/z925.6［M+H］+，(-)-ESI-MSm/z923.5［M-H］-。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ:9.61，9.47，9.29，9.02，8.96，8.91 (each 1H，br s，-OH)，8.82 (2H，br s，-OH)，8.60 (2H，br s，-OH)，7.27 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2a/6a)，6.96 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2d/6d)，6.79 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3a/5a)，6.69 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3d/5d)，6.50 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3c/5c)，6.41 (1H，d，J=1.4 Hz，H-12b)，6.36 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2c/6c)，6.28 (2H，d，J=8.3 Hz，H-3b/5b)，6.22 (1H，d，J=1.2 Hz，H-14c)，6.17(2H，d，J=8.4 Hz，H-2b/6b)，5.92 (1H，br s，H-12d)，5.87 (1H，d，J=1.3 Hz，H-12a)，5.84 (2H，br s，H-10a/14a)，5.78 (2H，d，J=1.3 Hz，H-12c/14b)，5.51 (2H，d，J=1.3 Hz，H-10d/14d)，5.41(1H，br s，H-7a)，4.99 (1H，d，J=5.8 Hz，H-7c)，4.97 (1H，d，J=12.0 Hz，H-7d)，4.85 (1H，d，J=3.5 Hz，H-7b)，4.18 (1H，br s，H-8a)，3.42 (1H，d，J=3.5 Hz，H-8b)，3.10 (1H，dd，J=4.7，5.0 Hz，H-8c)，2.88(1H，dd，J=10.5，5.6 Hz，H-8d);13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ:160.6 (C-11b)，160.4 (C-11c)，159.2 (C-13b)，158.5 (C-11a/13a)，157.84(C-11d/13d)，157.82(C-13c)，157.4 (C-4a)，157.2(C-4d)，156.8 (C-4b)，155.4 (C-4c)，146.1 (C-9a)，143.8 (C-9b)，138.0 (C-9d)，135.3 (C-9c)，133.5 (C-1a)，132.6 (C-1d)，132.1 (C-1b)，130.4(C-1c)，128.4 (C-2d/6d)，127.0 (C-2c/6c)，126.7(C-2b/6b)，126.0 (C-2a/6a)，123.2 (C-10c)，118.0 (C-10b)，115.7 (C-3a/5a)，115.5 (C-3d/5d)，115.1 (C-3b/5b)，114.9 (C-3c/5c)，109.5(C-14c)，107.5 (C-14b)，107.4 (C-10d/14d)，105.5 (C-10a/14a)，102.1 (C-12d)，101.1 (C-12a)，95.5 (C-12b)，95.2 (C-12c)，92.5 (C-7b)，91.7 (C-7a)，84.1 (C-7d)，83.8 (C-7c)，60.4 (C-8d)，56.1 (C-8a)，51.0 (C-8c)，50.4 (C-8b)。以上數(shù)據(jù)與文獻［2］報道基本一致，鑒定化合物2 為kobophenol A。

化合物3 黃色粉末(甲醇);C28H22O7，易溶于甲醇，UV 254 nm 顯暗斑，UV 365 nm 無熒光;10%硫酸乙醇溶液顯紫紅色。(+)-ESI-MSm/z471.3［M+H］+，(-)-ESI-MSm/z469.4［M-H］-。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ:9.55，9.26，9.19，9.09，9.02 (each 1H，br s，-OH)，6.99 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2b/6b)，6.74 (2H，d，J=8.3 Hz，H-2a/6a)，6.69(2H，d，J=8.5 Hz，H-3b/5b)，6.55 (2H，d，J=8.6 Hz，H-3a/5a)，6.42 (1H，d，J=1.9 Hz，H-14a)，6.27 (1H，d，J=1.7 Hz，H-12b)，6.04 (1H，d，J=1.9 Hz，H-14b)，5.98 (1H，br s，H-12a)，5.67 (1H，d，J=11.3 Hz，H-7b)，5.23 (1H，br t，J=4.6，4.9 Hz，H-8a)，5.15 (1H，d，J=4.6 Hz，H-7a)，4.85(1H，d，J=4.9 Hz，8a-OH)，3.95 (1H，d，J=11.3 Hz，H-8b);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δ:158.9(C-11a)，158.14 (C-13b)，158.11 (C-13a)，158.05(C-4a)，156.2 (C-4b)，155.4 (C-11b)，141.5 (C-9b)，140.0 (C-9a)，131.7 (C-1b)，129.6 (C-1a)，129.3 (C-2b/6b)，128.0 (C-2a/6a)，118.1 (C-10b)，117.7 (C-10a)，115.6 (C-3b/5b)，115.0 (C-3a/5a)，110.0 (C-14a)，104.1 (C-14b)，100.9 (C-12b)，96.3 (C-12a)，87.4 (C-7b)，69.6 (C-8a)，48.5 (C-8b)，42.9 (C-7a)。以上數(shù)據(jù)與文獻［3］報道基本一致，鑒定化合物3 為蛇葡萄素A(ampelopsin A)。

化合物4 黃色粉末(甲醇);C56H42O12，易溶于甲醇，UV 254 nm 顯暗斑，UV 365 nm 無熒光;10%硫酸乙醇溶液顯紅褐色。(-)-ESI-MSm/z451.8［M/2-H］-，905.6［M-H］-，推測化合物為一對稱結(jié)構(gòu)。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ:9.56 (2H，br s，-OH)，9.35 (2H，s，-OH)，9.14 (2H，br s，-OH)，8.99 (2H，br s，-OH)，8.40 (2H，s，-OH)，7.02(4H，d，J=8.5 Hz，H-2a/6a/2d/6d)，6.74 (4H，d，J=8.0 Hz，H-2b/6b/2c/6c)，6.72 (4H，d，J=8.5 Hz，H-3a/5a/3d/5d)，6.51 (4H，d，J=8.5 Hz，H-3b/5b/3c/5c)，6.36 (2H，d，J=1.2 Hz，H-12a/12d)，6.03 (2H，br s，H-14a/14d)，5.64 (2H，d，J=12.0 Hz，H-7a/7d)，5.60 (2H，d，J=1.8 Hz，H-12b/12c)，5.53 (2H，br s，H-7b/7c)，4.86 (2H，d，J=1.8 Hz，H-14b/14c)，4.01 (2H，d，J=12.0 Hz，H-8a/8d)，3.67 (2H，br s，H-8b/8c);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:158.3 (C-11b/11c)，158.1 (C-11a/11d)，157.8 (C-4a/4d)，156.4 (C-13a/13d)，156.2 (C-13b/13c)，155.0 (C-4b/4c)，141.0 (C-9a/9d)，139.8 (C-9b/9c)，133.9 (C-1b/1c)，129.6(C-2a/6a/2d/6d)，129.4 (C-1a/1d)，128.4 (C-2b/6b/2c/6c)，119.4 (C-10a/10d)，117.1 (C-10b/10c)，115.6 (C-3a/5a/3d/5d)，114.9 (C-3b/5b/3c/5c)，110.6 (C-14b/14c)，105.2 (C-14a/14d)，100.4 (C-12a/12d)，94.6 (C-12b/12c)，87.3 (C-7a/7d)，48.7 (C-8a/8d)，47.5 (C-8b/8c)，40.5(C-7b/7c)。2D-NMR 相關(guān)譜如圖3 所示。綜上所述，并參考文獻［4］報道的數(shù)據(jù)，鑒定化合物4 為isohopeaphenol。

化合物5 黃褐色粉末(甲醇);C56H44O13，易溶于甲醇，UV 254 nm 顯暗斑，UV 365 nm 顯藍色熒光;10%硫酸乙醇溶液顯褐色。(+)-ESI-MSm/z925.4 ［M+H］+，(-)-ESI-MSm/z923.6 ［MH］-。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ:8.92-9.58(9H，br d，-OH)，8.67 (1H，br s，-OH)，6.74 (2H，d，J=8.5 Hz)，6.49-6.58 (12H，m，overlapped)，6.41 (1H，br s，H-14a)，6.40 (2H，d，J=8.2 Hz)，6.20 (1H，br s)，6.14 (1H，br s)，6.06 (1H，d，J=1.4 Hz，H-12c)，6.03 (2H，d，J=1.8 Hz)，5.86(1H，d，J=1.5 Hz，H-12b)，5.52 (1H，d，J=1.5 Hz，H-14b)，5.17 (1H，d，J=4.2 Hz，H-7a)，5.03(1H，d，J=4.5 Hz，H-7d)，4.88 (1H，d，J=10.1 Hz，H-7c)，4.46 (1H，d，J=9.3 Hz，H-7b)，3.96(1H，d，J=4.2 Hz，H-8a)，3.91 (1H，d，J=4.6 Hz，H-8d)，3.77 (1H，dd，J=9.6，11.6 Hz，H-8b)，3.56(1H，dd，J=11.2，10.8 Hz，H-8c);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δ:160.2，159.3，159.0，158.6，157.8，157.7，157.5，157.4，156.4，147.6 (C-9a)，147.4 (C-9d)，137.6 (C-9c)，135.3 (C-9b)，132.2，131.8，131.7，129.4，128.4，128.3，128.2，122.1，121.7，115.6，115.5，115.4，114.8，109.7(C-14b)，106.0 (C-10a/14a/10d/14d)，104.5 (C-14c)，101.5，101.4，96.1 (C-12b)，95.5 (C-12c)，93.9 (C-7d)，92.4 (C-7a)，84.2 (C-7c)，81.2 (C-7b)，58.2 (C-8b)，54.3 (C-8a)，53.4 (C-8d)，50.4(C-8c)。2D-NMR 相關(guān)譜如圖4 所示。綜上所述，并參考文獻［5］報道的數(shù)據(jù)，鑒定化合物5 為grandiphenol A。

圖4 化合物5 的HMBC 和TOCSY 相關(guān)譜Fig.4 Key HMBC and TOCSY correlations of compound 5

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