HPLC法測定養(yǎng)陰降糖膠囊中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

陳登豐，何孝金（1.福建中醫(yī)藥大學附屬南平市人民醫(yī)院，福建南平 353000；.南平市藥品檢驗所，福建南平 353000）

養(yǎng)陰降糖膠囊系我院名老中醫(yī)經(jīng)驗方，主要由玄參、地黃、蒼術(shù)、黃芪等組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱降糖的作用，臨床用于氣陰不足、內(nèi)熱消渴，證見煩熱口渴、多飲多食、倦怠乏力。2 型糖尿病即見上述證候。該藥在福建中醫(yī)藥大學附屬南平市醫(yī)院（簡稱“我院”）臨床使用多年，療效確切。玄參在該制劑中為君藥，哈巴苷、哈巴俄苷為玄參主要藥效成分［1-2］。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）-梯度洗脫法同時測定該制劑中哈巴苷、哈巴俄苷的含量，以建立該制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent1100 高效液相色譜儀；梅特勒XS205DU 電子天平；Millipore超純水器。

養(yǎng)陰降糖膠囊由本院制劑室提供；哈巴苷（批號：110729-201204，含量：94.5%）、哈巴俄苷（批號：110730-201106，含量：96.0%）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.03%磷酸，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。在此條件下，哈巴俄苷和哈巴苷與樣品中其他成分達到基線分離，色譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備。精密稱取哈巴苷對照品20.36 mg、哈巴俄苷對照品18.30 mg，分別置于10 ml 量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對照品儲備液Ⅰ（含1.924 0 g/L哈巴苷）、Ⅱ（含1.756 8 g/L哈巴俄苷）。

圖1 高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.陰性對照溶液；C.混合對照品；D.黃芪溶液；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷Fig 1 HPLC chromatograms A.test solution；B.negative control solution；C.mixed reference；D.astragalus solution；1.harpagide；2 harpagoside

2.2.2 供試品溶液的制備。取養(yǎng)陰降糖膠囊內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備。按處方比例制備及不含玄參的陰性樣品，另取黃芪，同“2.2.2”項下制備方法制備陰性對照溶液及黃芪溶液。

2.3 干擾試驗

取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液，分別按“2.1”項下色譜條件測定，色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對照品儲備液Ⅰ、Ⅱ各100μl，置于10 ml 量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度，制成每1 ml 分別含哈巴苷19.240 2μg、哈巴俄苷17.568 0μg的混合溶液，進樣1、2、5、10、20μl，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標、進樣量（x）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y哈巴苷＝0.349 337x哈巴苷+0.182 619（r＝1.000 0，n＝5）；y哈巴俄苷＝1.729 49x哈巴俄苷+0.228 873（r＝1.000 0，n＝5）。結(jié)果表明，哈巴苷在19.240～384.800 ng、哈巴俄苷在17.568～351.360 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 最低定量限

將對照品儲備液Ⅰ、Ⅱ按逐步稀釋法分別稀釋，測定其最低定量限。當信噪比約為10∶1時，哈巴苷、哈巴俄苷的最低定量限分別為3.0、2.0 ng。

2.6 穩(wěn)定性考察

取“2.2.1”“2.2.2”項下溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24、36、48 h測定。結(jié)果供試品溶液中哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.41%、0.23%，對照品溶液中哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為0.35%、0.68%，表明供試品溶液與對照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗

取“2.4”項下的對照品混合溶液進樣5 次，每次10μl。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.21%、0.16%，表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，按“2.2.2”項下方法制備溶液6份，按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為2.01%、2.23%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

按“2.2.2”項下取樣量的1/2，稱取已知含量的同一批樣品5份，每份加入對照品儲備液Ⅰ75μl、對照品儲備液Ⅱ40μl，依法制備、測定并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of recovery test（n＝5）

2.10 樣品測定

取6批養(yǎng)陰降糖膠囊按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以外標法計算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品的含量測定結(jié)果Tab 3 Content determination results of samples

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，養(yǎng)陰降糖膠囊各味藥均有降糖作用，其中地黃、玄參滋陰、清熱、補肝腎，黃芪、蒼術(shù)益氣、補脾腎。地黃配黃芪能益氣、生津、止渴，可有效改善糖尿病患者口渴多飲、氣短乏力等癥狀；玄參、蒼術(shù)合用以玄參之潤制蒼術(shù)之燥，以蒼術(shù)溫燥防玄參滯膩，兩藥相互制約、相互促進，可減輕糖尿病患者全身燥熱、口渴多飲的癥狀。全方諸藥合用，具有益氣養(yǎng)陰、清熱降糖的功效。

玄參的特征成分為環(huán)烯醚萜類，如哈巴苷和哈巴俄苷，現(xiàn)行版《中國藥典》已收載了兩者的含量測定，但關(guān)于復(fù)方制劑中玄參的哈巴苷及哈巴俄苷含量測定鮮有報道［3-6］。本文所建立的方法合理可行，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及回收率均良好，可為玄參的復(fù)方制劑如養(yǎng)陰降糖膠囊的含量測定提供參考。

供試品中多味藥含有苷類成分，如黃芪（見圖1）所含苷類成分對哈巴俄苷的測定影響較大，故選擇分離方法就顯得至關(guān)重要。筆者通過色譜分離及梯度洗脫，達到了簡單、實用、效率高、損失少的目的。若僅測定玄參中哈巴苷及哈巴俄苷，只需乙腈-0.03%磷酸（25∶75）等度洗脫即可，無需梯度洗脫。

在供試品溶液的制備中，筆者進行了冷浸法、回流法、超聲法的對比研究，結(jié)果三者無顯著性差別。為保證試驗效率，選擇超聲提取方法。筆者還考察了超聲提取時間對提取率的影響，結(jié)果超聲提取20 min含量已達穩(wěn)定。為保證提取效率，選擇提取時間為30 min。

綜上，本文建立的方法專屬性強，可排除其他非目標測定物的干擾，測定結(jié)果準確、相關(guān)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制。

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