HE染色細胞核灰染的處理方法比較研究

陳貴東 沈 艷 楊 通 黃 薇 梁英杰

（1廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院病理科；2中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣東511447）

HE染色是病理活檢制片最常用的染色方法，染色質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響讀片和診斷。在HE染色過程中細胞核著色淺甚至不著色、組織結(jié)構(gòu)模糊、核質(zhì)對比不清的現(xiàn)象常常導致無法進行病理診斷。因此，探討一種便捷有效的處理HE染色發(fā)灰的方法具有重要意義。通過對10例HE染色細胞核灰染的胃粘膜、腸息肉和子宮內(nèi)膜等不同類型的組織進行重新切片，采用多種不同的方法進行處理，比較發(fā)現(xiàn)：PBS微波處理法染色效果最佳，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1.材料

HE染色細胞核灰染的胃粘膜、腸息肉、子宮內(nèi)膜等共10例，重新切片，厚度0.3um。通過調(diào)整蘇木素染色條件以及染色前對組織進行修復處理，進行HE染色，比較處理效果。

2.方法

2.1 調(diào)整蘇木素染色條件的方法 具體步驟：（1）切片脫蠟至水。（2）切片分四組處理，A：常規(guī)法（對照組），室溫下切片浸染蘇木素5min；B：延長時間法，室溫下蘇木素染色時間延長至2h；C：水浴加熱法，切片置于濕盒內(nèi)放入37℃水浴箱中，蘇木素滴染30min；D：微波加熱法，切片置于耐高溫染色缸內(nèi)，放入格蘭仕P70D20TP－C6（W0）微波爐中調(diào)至中低檔，蘇木素滴染1min。（3）蘇木素染色完畢，依次進行分化、返藍、伊紅染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察。

2.2 染色前組織修復處理的方法 具體步驟：（1）切片脫蠟至水。（2）切片按以下方法處理，①：高壓處理法，分別將切片完全浸入PBS（PH7.2－7.4）、EDTA（PH8.0）和檸檬酸修復液（PH6.0），用高壓鍋隔水加熱，連續(xù)噴氣3min后自然冷卻；②：微波處理法，分別將切片完全浸入PBS、EDTA和檸檬酸修復液，放入微波爐中調(diào)至中低檔加熱至沸騰計時3min，自然冷卻；③：水煮法，將切片完全浸入雙蒸水中，加熱至沸計時5 min，自然冷卻。（3）將對照片（即未處理）與（2）中各方法處理過的切片一同水洗后，蘇木素染色5min，依次進行分化、返藍、伊紅染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察。

結(jié) 果

1.調(diào)整蘇木素染色條件的染色結(jié)果

常規(guī)法即未調(diào)整蘇木素染色條件的切片灰染現(xiàn)象嚴重：核染色不良，尤其腺體部位染色淺甚至不著色，呈白霧狀，組織結(jié)構(gòu)模糊不清，紅藍對比不鮮明，透明度差。而延長時間法、水浴加熱法和微波加熱法均能不同程度地促進核染色，蘇木素著色加深，但細胞結(jié)構(gòu)仍不清晰，切片略灰尤其腺體部位發(fā)白，紅藍對比和透明度也不夠理想，未能完全達到閱片診斷的要求。

2.染色前組織修復處理的染色結(jié)果

水煮法雖能促進細胞核染色但發(fā)灰現(xiàn)象未能完全解決，達不到閱片診斷的要求。而PBS、EDTA、檸檬酸三種修復液分別采用高壓處理和微波處理均能較好地改善細胞核灰染現(xiàn)象。其中以PBS微波處理法效果最佳：組織結(jié)構(gòu)清晰，紅藍對比鮮明，核漿染色良好，透明度佳。具體見圖1、2。

圖1 細胞核灰染的不良染色HE 40×圖2 采用PBS微波法處理 HE 40×Fig.1 poor staining of the nucleus in gray HE 40×Fig.2 treated by PBS and microwave heating HE 40×

討 論

常規(guī)病理活檢制片過程中出現(xiàn)切片經(jīng)HE染色后細胞輪廓及核內(nèi)染色質(zhì)、核仁顯示不清發(fā)灰，呈局部或成片淡染發(fā)白，紅藍對比不鮮明，透明度差等問題屬于灰染現(xiàn)象。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因多且復雜［1］，根據(jù)HE染色的原理，細胞核與堿性染料蘇木素相結(jié)合，因此核染色效果差既可能受組織細胞自身酸堿平衡和帶電狀態(tài)的影響，也可能受蘇木素染色能力的影響。具體而言，其可能的影響因素包括：標本離體后固定不及時導致組織細胞自溶；固定液及濃度選擇不當導致固定不充分；組織脫水不徹底導致發(fā)白發(fā)軟；蘇木素陳舊導致染色能力下降等。本研究所收集到的10例HE灰染的組織來自不同的處理批次，每一例灰染的組織與同批次的其他標本均在相同的條件下進行脫水、包埋、切片、染色，但未發(fā)現(xiàn)相同類型或其他類型的組織有灰染現(xiàn)象。因此，可以排除脫水、浸蠟以及蘇木素染色等環(huán)節(jié)的影響，其最有可能的原因是組織固定不及時。離體標本固定不及時容易出現(xiàn)組織自溶，從而改變細胞內(nèi)物質(zhì)的酸堿性質(zhì)和帶電狀態(tài)，導致細胞核灰染。

關(guān)于HE染色細胞核灰染的處理方法有延長蘇木素染色時間［2，3］、熱處理［1，4］、加酸處理［5］等。本研究對各種不同的處理方法進行綜合比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）延長蘇木素染色時間能夠使細胞核與蘇木素更充分的結(jié)合，細胞核染色質(zhì)量有所改善但局部區(qū)域灰白發(fā)霧現(xiàn)象未能徹底解決。（2）水浴加熱法既延長了染色時間（30min）又升高了染色溫度（37℃），相比單一延長蘇木素染色時間效果更佳，但局部發(fā)灰發(fā)白現(xiàn)象依然存在，核漿對比不夠鮮明，切片染色略灰。（3）微波加熱法通過提高分子的運動速度，增加細胞的滲透性和溶劑分子的穿透力［6］，提高蘇木素染色能力，但由于微波加熱時蘇木素滴染容易出現(xiàn)干涸而導致染色不均，整體染色效果未能完全達到閱片要求。如果能夠控制好微波加熱的溫度和時間，同時采用蘇木素浸染可能效果會進一步改善。（4）PBS、EDTA、檸檬酸修復液分別通過高壓和微波處理均能不同程度地改善細胞核灰染現(xiàn)象，尤其是PBS微波處理法效果最好。PBS微波處理法有兩大優(yōu)點：一是PBS相比EDTA和檸檬酸更好地提供了一個PH適中的緩沖水環(huán)境，使組織細胞內(nèi)的酸、堿性物質(zhì)部分恢復或接近原帶電荷狀態(tài)［7］，促進與染色基團的結(jié)合，使核漿染色更接近原來的水平。二是微波處理相比高壓處理更溫和，能夠產(chǎn)生均勻的熱效應，使組織細胞間隙增大，有利于染料分子的穿透吸附。（5）水煮法因PH環(huán)境不如PBS緩沖液，沸騰水煮的熱效應也不如微波處理而且更容易掉片，因此染色效果相對較差。綜上所述，通過調(diào)整蘇木素染色條件以及染色前對組織進行修復處理能夠促進細胞核染色，但對灰染現(xiàn)象的改善程度不一，以PBS微波處理法效果最佳。

HE染色細胞核灰染現(xiàn)象在日常病理制片過程中難免發(fā)生，其影響因素眾多，及時有效地做好固定、取材、脫水、浸蠟、切片、染色等環(huán)節(jié)的工作并加強質(zhì)控管理，是預防該現(xiàn)象的關(guān)鍵。

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