惡性胸腔積液中肺腺癌的EGFR、VEGF和P53的表達及分子生物學意義

方長清 姜躍峰 姜海嬌 方思涵 李建華＊

（1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學病理教研室，2遼寧大學經(jīng)濟學院，沈陽110001）

肺癌是目前癌癥中致死率最高的一種，其中原因之一就是患者在初診時往往都處于肺癌晚期，惡性胸腔積液是晚期肺癌常見的并發(fā)癥之一，且能夠降低病人的生存期［1］。而對于晚期肺癌的治療，如何使用經(jīng)濟、有效的化療藥物來延長患者的生存期，是目前臨床治療面臨的主要問題，而靶向藥物的使用是其中最主要的方法之一。

EGFR（epidermal growth factor receptor）表皮生長因子是廣泛存在于細胞膜上的一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶，參與的信號通路主要包括MAPK通路、PI3K 通路、c－Src通路等［2］。有研究表明在腫瘤的發(fā)展過程中，EGFR的高表達可以促進腫瘤細胞的增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移［3］，且它的高表達與其發(fā)生基因突變密切相關(guān)［4］。而發(fā)生EGFR基因突變的患者可使用酪氨酸激酶抑制劑靶向治療，如吉非替尼。惡性腫瘤的生長依賴機體提供的營養(yǎng)和氧氣，而當腫瘤組織生長大于2 mm時必須需要血管來提供養(yǎng)分，此時腫瘤細胞在缺氧的情況下可以通過自身和周圍組織分泌多種生長因子來刺激血管的生成，其中 VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長因子）是刺激血管生成重要的因子，它可以促進血管內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性。近年針對VEGF為靶點的藥物研究已有一定進展［5］。P53基因的突變是腫瘤形成早期的重要事件，已在多種腫瘤組織中得到證實。野生型的P53基因具有抑制腫瘤的作用，而發(fā)生突變后失去了抑制作用，有研究顯示，在肺癌中P53具有較高的突變率，對于肺癌的形成具有重要作用。

本研究對惡性胸腔積液中的肺腺癌細胞進行提取與收集，對EGFR、VEGF和P53進行表達檢測，并進行相關(guān)性統(tǒng)計，對其表達意義進行分析，進一步理解腫瘤細胞的惡性生物學行為和探討對臨床治療的指導意義。

材料和方法

1.臨床樣本

收集2011到2012年中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及病房中未經(jīng)治療的77例肺腺癌患者惡性胸腔積液作為研究對象，經(jīng)細胞及組織病理和免疫化學染色診斷為腺癌。男37例，女40例，年齡從36至83歲，平均年齡為59歲。

2.液基細胞薄層檢測技術(shù)（ThinPrep Cytology Test，TCT）

收集新鮮胸水25 ml 2管2000 r／min離心5 min后，棄掉上清液，加入細胞清洗液繼續(xù)2000 r／min離心5 min后，吸取適量沉淀物加入細胞保存瓶內(nèi)，靜置10 min左右，用新柏氏液基細胞儀制成薄層細胞涂片，并進行巴氏染色和鏡下診斷。

3.切片制備與HE染色

采用TCT常規(guī)制片，診斷后，每份標本收集新鮮胸水200 ml左右，室溫下2000 r／min離心5 min，取細胞沉渣，經(jīng)95%乙醇固定12 h后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，HE染色后，鏡下觀察，篩選切片。

4.免疫細胞化學技術(shù)：

常規(guī)石蠟包埋切片后，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶法（streptavidin－peroxidase，SP法）進行免疫細胞化學染色。切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化，0.01 mol／l檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復3 min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液37℃孵育30 min；一抗4℃孵育過夜，EGFR、VEGF、P53稀釋比例為1∶100；辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育30 min；鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37℃孵育30 min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復染，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

免疫細胞化學結(jié)果判定標準：細胞質(zhì)或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細胞，著色強度分為：無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細胞數(shù)分為：＜10%為0分，10%－50%為1分，＞50%為2分，兩項得分相乘結(jié)果＞2記為陽性（＋），＜2為陰性（－）。

5.統(tǒng)計分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，基因表達與臨床特征之間的關(guān)系采用chi－square test或者Fisher＇s exact test，兩者相關(guān)性用非參數(shù)spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

TCT結(jié)果鏡下顯示細胞散在分布，核異型性明顯，核質(zhì)粗糙，N／C比例升高，核膜清晰，核大小不等，初步診斷為可疑瘤細胞；而在良性腹水中則以炎性細胞為主（圖1A）。HE及免疫細胞化學結(jié)果顯示上皮性腫瘤標志物CK7和TTF－1表達陽性（圖1B－D）。EGFR、VEGF和P53分別表達于細胞膜和細胞漿、細胞漿、細胞核（圖2A－C），表達率分別為71.4%、74%和40.3%（如表1），EGFR與 VEGF的表達成正相關(guān)（r＝0.609，P＝0.000）（表2）。

表1 惡性胸腔積液中肺腺癌細胞的EGFR、VEGF、P53的表達率Table 1 The expression rates of EGFR、VEGF and P53 of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusion

表2 EGFR和VEGF表達的相關(guān)性Table 2 The correlation of EGFR and VEGF expression

圖1 A－B：惡性胸腔積液中肺腺癌細胞的TCT和HE染色。C－D：CK7、TTF－1在肺腺癌細胞中的表達（×400）.圖2 A－C：惡性胸腔積液中肺腺癌細胞的EGFR、VEGF和P53的表達（×400）。Fig.1 A－B：TCT and HE staining of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusion.C－D：CK7、TTF－1 positive expression in lung adenocarcinoma cell（×400）.Fig.2 A－C：EGFR，VEGF and P53 positive expression of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusion（×400）.

討 論

EGFR是一種跨膜糖蛋白，它屬于表皮生長因子基因（erbB）受體家族的一員，結(jié)構(gòu)上包括由細胞外的結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及主要由酪氨酸激酶組成的細胞內(nèi)區(qū)等。EGFR活化后激活多條下游的信號通路近而介導生長作用或致癌［6］。表皮生長因子受體在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達率為43%－89%，其介導的信號通路影響著腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成［7，8］。EGFR基因定位于人類第7號染色體短臂，包括28個外顯子，EGFR基因突變的主要集中在19和21，兩者共約占所有突變的90%［9］。多項研究證實：對EGFR基因突變患者使用EGFR－TKI（吉非替尼或厄洛替尼）與化療相比，可顯著延長患者PFS，并具有較高的疾病反應(yīng)率，且具有良好的耐受性。同時，亞裔、女性、不吸煙及腺癌患者為 EGFR－TKI治療的優(yōu)勢人群［3］。目前EGFR基因突變的檢測已成為臨床指導EGFRTKI用藥的共識，但EGFR基因的檢測較昂貴，而臨床免疫化學EGFR的表達的檢測則相對廉價，有研究表明其表達強度與基因突變具有關(guān)聯(lián)性［4］，因此對EGFR進行免疫化學檢測，對于指導臨床用藥，改善患者預后具有重要意義。

VEGF作為特異性的血管內(nèi)皮細胞分裂素，能夠刺激體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞發(fā)生有絲分裂和遷移，以及體內(nèi)血管的形成。血管的發(fā)生對于腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都發(fā)揮了重要作用，在這個過程中VEGF這種血管內(nèi)皮細胞特異性生長因子起著重要的調(diào)節(jié)作用，它可促進腫瘤血管新生。在多種腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)其高表達，包括肺癌、胃癌、大腸癌和乳腺癌，且高表達者預后不良［10］。以VEGF為把目標的化療藥物的研究已有一定的進展，包括貝伐單抗等，并在臨床化療中取得良好的效果，雖有一定的副作用，但提高了患者的生存期，這為腫瘤治療提供了新思路［11］。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，多種基因表達狀態(tài)的改變和相互作用起到了重要作用，我們的研究顯示，在惡性胸腔積液的肺腺癌細胞中，EGFR和VEGF具有較高的表達率，且二者的表達之間具有較高的相關(guān)性，有研究顯示，EGFR可以促進腫瘤組織的血管形成，我們猜測EGFR可以通過信號通路上調(diào)VEGF進而促進腫瘤血管的形成。在惡性胸腔積液的臨床診斷過程中，發(fā)現(xiàn)有部分患者的腫瘤細胞可相互連接成管腔樣結(jié)構(gòu)，有報道顯示其與腫瘤血管生成擬態(tài)有關(guān)［12］。在我們的研究中有40.3%的P53表達，p53為一種抑癌基因，有研究顯示野生型的P53基因具有多種功能，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定基因組、抑制細胞周期進展、促進細胞凋亡，甚至還可能抑制血管形成。而發(fā)生突變的基因不僅失去了原有的生物學功能而且還會干擾原有的功能［13］，這進一步刺激和促進了腫瘤的發(fā)生。針對其突變的基因治療仍處于臨床試驗階段。目前針對肺癌治療的藥物已有多種，但由于耐藥的出現(xiàn)及其他方面的原因，治療的效果一直不理想，而進行針對不同機制的聯(lián)合用藥也許能改善患者的預后，而對于藥物的正確選擇還需要進行臨床試驗的研究。惡性胸腔積液中的腫瘤細胞是較容易獲得的一種診斷樣本，對于肺癌的治療，目前提出個體化的概念，是根據(jù)每一位患者自身不同的狀態(tài)條件而進行不同的治療方案，因此無論是靶向治療還是基因治療都需要進行治療前相關(guān)因子的檢測，而惡性胸腔積液中的腫瘤細胞的獲取進而進行檢測，不僅是一種既方便有經(jīng)濟的手段而且對患者的創(chuàng)傷較小，這對于肺癌晚期患者的治療具有重要意義。

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