光周期對不同秋眠型苜蓿光敏色素和內(nèi)源激素的影響

樊文娜，孫曉格，倪俊霞，杜紅旗，史瑩華，嚴學兵，王成章

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002)

苜蓿(Medicago sativa)為長日照植物，秋冬短日照下休眠，說明苜蓿秋眠(fall dormancy，F(xiàn)D)存在著光周期效應(yīng)［1-3］。不同苜蓿品種對低溫和短日照的反應(yīng)有差異，據(jù)此可將其分為秋眠型(fall dormancy，1～3級)、半秋眠型(semi-fall dormancy，4～6級)和非秋眠型(non-fall dormancy，7～9級)3種類型［4］。秋眠型苜蓿夏末和早秋即進入休眠，停止生長時間早，秋季產(chǎn)量低;非秋眠型苜蓿秋季休眠晚，只要溫度等條件適宜，仍可繼續(xù)旺盛生長，有較高的秋季產(chǎn)量;半秋眠型苜蓿正好介于二者之間［5-6］。

據(jù)研究，植物感受和測量日照長短是通過葉片中的光受體完成的。在植物的光形態(tài)建成中，光敏色素是主要的光受體。對擬南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的研究表明，雙子葉植物中至少存在5種不同的光敏色素基因，即 PHYA、PHYB、PHYC、PHYD 和 PHYE［7］，光敏色素 A(phytochrome A，PHYA)和光敏色素 B(phytochrome B，PHYB)是主要的光敏色素，在植物的生長發(fā)育中有重要作用［8］，植物的種子萌發(fā)、生長、開花和休眠等生長發(fā)育過程與其密切相關(guān)［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，植物的光受體信號基因往往是通過其內(nèi)源激素傳遞給靶基因從而調(diào)控其生長發(fā)育的［10-11］。既然光周期是影響苜蓿秋眠性的主要環(huán)境因子，秋季日照長度的變化就可能通過光受體基因PHYA、PHYB的表達和植物激素的合成調(diào)控其休眠，因此研究不同秋眠型苜蓿PHYA、PHYB的表達量和植物激素含量能在很大程度上探明其與苜蓿秋眠性的關(guān)系。

光敏色素和內(nèi)源激素在調(diào)控苜蓿秋眠性上可能有互作關(guān)系，PHYB(或PHYA)調(diào)節(jié)脫落酸 (abscisic acid，ABA)、赤霉素3(gibberellin，GA)等植物內(nèi)源激素的生成、轉(zhuǎn)化和代謝以及植物對ABA、GA3等的敏感程度，進而影響植物的生長發(fā)育。GA3與ABA是2個對植物生理作用相反的激素，ABA能促進秋眠，GA3有解除秋眠的作用，噴灑外源ABA能促進內(nèi)源ABA的累積，有利于苜蓿的秋眠［11］。由于ABA能誘導(dǎo)抗寒等逆境基因的表達，因此在短日照處理下ABA水平增加，可能會加強苜蓿秋眠基因的誘導(dǎo)與表達，從而調(diào)控和促進秋眠。內(nèi)源激素可能是調(diào)節(jié)秋眠性的化學信使，GA3/ABA、生長素 (indole acetic acid，IAA)/ABA和玉米素核苷(zeatinR，ZR)/ABA的變化可反映促進生長的激素和抑制生長的激素之間的相對平衡狀態(tài)，PHYB作為綠色植物主要光受體可能通過光周期調(diào)控激素合成和其平衡進而調(diào)控或參與了苜蓿的秋眠［11-14］，因此，PHYA、PHYB以及植物激素之間的關(guān)系用以研究苜蓿秋眠性機理有重要意義。

本研究的目的在于探討不同光周期條件下不同秋眠型苜蓿PHYA、PHYB mRNA的表達量，揭示日照長度與不同秋眠型苜蓿光受體基因表達之間的關(guān)系;測定內(nèi)源激素含量與光受體基因表達之間有無互作關(guān)系。從而為揭示苜蓿秋眠性的調(diào)控機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗設(shè)計

選取苜蓿秋眠性標準對照品種Norseman(FD1)、Dupuils(FD5)和 CUF101(FD9)，于2009年9月20日種植于河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)牧草試驗地，2010年8月20日選擇生長健壯、均勻一致的苜蓿植株移植于花盆(24 cm×24 cm)中，待其成活后轉(zhuǎn)入人工氣候室。實驗設(shè) 7 h/d、10 h/d(SD，短，short day)、13 h/d(MD，中，middle day)和 16 h/d(LD，長，long day)光照處理，每個處理重復(fù)6次，定時定量澆水。溫度設(shè)置為:光照20℃/黑暗10℃，處理35 d。隨機摘取各株頂芽及上部葉片，無菌錫箔紙包裹，立即由液氮固定，并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存待用。為接近自然光質(zhì)的能量和輻射強度，采用全光譜燈和LED燈，光照設(shè)備由南京農(nóng)業(yè)大學李志剛老師設(shè)計并提供(圖1)。

圖1 全光譜的光譜能量分布圖Fig.1 Plant lights spectral energy distribution of the full spectrum

1.2 PHYA、PHYB 引物設(shè)計

引物參考本實驗室提供的PHYA、PHYB基因全長［15-17］設(shè)計，通過熒光定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng))測定其mRNA表達量。

PHYA-s:5'-GAGAGATAGCTTTATGGATGTCTGAGT-3'(27 bp)，PHYA-a:5'GCGACCTAAACCAG-AAAACTATG T-3'(24 bp)，PHYA 的擴增片段長度為 168 bp;PHYB-s:5＇-GTAGAGGACGCTATGGGGAAGT-3'(22 bp)，PHYB-a:5'-TGGAGCAAGCATTCACCACTAT-3'(22 bp)，PHYB的擴增片段長度為146 bp。

1.3 RNA的提取及PCR檢測

將紫花苜蓿葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉狀，按照RNA提取試劑(Takara，RNAiso Plus)上的操作說明提取總RNA。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看到RNA 28S和18S的條帶清晰，28S為18S的2倍，RNA完整性良好。取總RNA 2 μL在微量核酸檢測儀上檢測質(zhì)量，OD260/280值均在1.8～2.0之間，RNA質(zhì)量好，純度高。對cDNA進行PCR擴增，均得到168和146 bp大小的產(chǎn)物(如圖3)。

1.4 PHYA、PHYB 片段克隆測序

提取苜蓿中總RNA，以此為模板進行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對目的片段進行切膠、純化回收，將2個基因分別與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞，藍白菌落進行初步篩選，隨機挑取白色菌落進行菌液培養(yǎng)，然后將含pGM-T-PHYA、PHYB質(zhì)粒的菌液送寶生物工程(大連)有限公司進行測序、鑒定。

圖2 紫花苜?？俁NA提取結(jié)果Fig.2 Detection of total RNA in alfalfa

圖3 PHYA和PHYB PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of PHYA and PHYB fragments

通過測序分析，其結(jié)果與設(shè)計引物所用模板序列完全一致，NCBI中比對分析的結(jié)果與紫花苜蓿品種WL-525HQ的PHYA、紫花苜蓿品種Vernal的PHYB基因序列一致，說明由引物得到的PHYA、PHYB的RT－PCR產(chǎn)物與目的基因相符。

1.5 標準品和標準曲線及計算方法

提取PHYA、PHYB的重組質(zhì)粒作為標準品。質(zhì)粒制備后，用紫外分光光度計對質(zhì)粒模板進行定量并梯度稀釋成 1011，1010，109，108，107，106，105，104拷貝/μL，作為陽性定量標準模板，制備標準曲線。實時熒光定量系統(tǒng)對收獲的PHYA和PHYB的cDNA的拷貝數(shù)進行精確定量，并根據(jù)測定結(jié)果，計算出光敏色素在不同光周期條件下的標準曲線［18-21］。根據(jù)公式和重組質(zhì)粒的分子量計算出標準品核酸的摩爾濃度，然后依據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023換算成該質(zhì)粒核酸每微升拷貝數(shù)(copy/μL)。PHYA的質(zhì)?？截悢?shù)為4.08×1010拷貝/μL;PHYB的質(zhì)?？截悢?shù)為5.11 ×1010拷貝/μL。PHYA 的標準曲線為 yA= －3.43x+45.85，相關(guān)系數(shù)為0.999;PHYB 的標準曲線為 yB= －3.26x+46.90，相關(guān)系數(shù)為0.998。

在每份樣品中檢測PHYA、PHYB的CT值(PCR反應(yīng)每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，并進行3次PCR重復(fù)，取3次PCR CT值的平均值，根據(jù)標準曲線計算定量結(jié)果，計算校正值。

1.6 PHYA、PHYB 反應(yīng)條件的優(yōu)化

光周期實驗中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制及其反應(yīng)條件如下:25 mmol/L硫酸鎂2 μL，緩沖液5 μL，無酶水0.75 μL，DNA 聚合酶的底物(10 mmol/L)0.5 μL，RNA 酶抑制劑 RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，反轉(zhuǎn)錄酶(22 U/μL)0.5 μL，隨機引物 0.5 μL，陽性對照 RNA 0.5 μL，共10 μL。反應(yīng)體系SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μL，PCR 上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，PCR 下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，熒光染料(50 × )0.4 μL，DNA模板2.0 μL，無酶水6.8 μL，共 20 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)參數(shù)為95℃30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40 個循環(huán)。擴增完畢后，進行熔解曲線分析，94℃ 1 min，60℃ 1 min，以0.10℃/s的速度升溫到92℃，連續(xù)監(jiān)測熒光。

1.7 植物激素的測定方法

在同時間內(nèi)隨機摘取各處理每株頂芽及上部葉片1 g左右，無菌錫箔紙包裹，立即由液氮固定，并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存待用。激素的測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays，簡稱ELISA)，ELISA試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學作物化學控制中心提供。酶標儀的型號為Thermo Multiskan MK3。每個樣品測定3次重復(fù)，取其平均值進行分析。

2 結(jié)果與分析

由圖4，圖5可知，隨著光照時間的增長，3種秋眠類型苜蓿品種葉片中的PHYA、PHYB mRNA表達量均成下降態(tài)勢。3種不同秋眠類型比較，PHYA表達量均隨著苜蓿秋眠性的下降依次降低(7 h/d除外);秋眠型苜蓿和非秋眠型苜蓿PHYB mRNA表達量在不同光周期條件下，也有隨著苜蓿秋眠性的下降而依次降低的趨勢，但半秋眠型苜蓿這種規(guī)律性不明顯。

由表1可知，隨著光照時間的延長，3種秋眠類型苜蓿的GA3含量基本上均呈上升趨勢，其中Norseman變化趨勢最為明顯，各處理之間差異都極顯著;同一個光照時間不同秋眠類型GA3含量之間無規(guī)律性，但Norseman GA3含量高于Dupuils和CUF101。

ABA含量的變化趨勢正好與GA3相反，隨著光照時間的延長，無論是秋眠型苜蓿Norseman、半秋眠型苜蓿Dupuils，還是非秋眠型苜蓿CUF101，均呈依次下降的趨勢，且不同光照處理間差異均極顯著，其中尤以Norseman ABA的含量變幅最大。同一個光照時間不同秋眠類型ABA含量比較，無論哪一個日照長度，均呈現(xiàn)出Norseman＞Dupuils＞CUF101，且差異顯著。

3種秋眠類型苜蓿的ZR含量并無規(guī)律性，但以Dupuils的最高。對IAA的含量來說，每一個秋眠類型品種都有隨著光照時間的延長而提高的趨勢(個別時間除外)，且差異顯著;除7 h/d的光照處理外，其余光照時間處理均Norseman＜Dupuils＜CUF101，大部分都達到了差異極顯著程度。

圖4 光照對不同秋眠型苜蓿PHYA mRNA表達量的影響Fig.4 Photoperiod effect on PHYA mRNA expression of alfalfa with different fall-dormancy

圖5 光照對不同秋眠型苜蓿PHYB mRNA表達量的影響Fig.5 Photoperiod effect on PHYB mRNA expression of alfalfa with different fall-dormancy

表1 光周期對不同秋眠型紫花苜蓿內(nèi)源激素含量的影響Table 1 Photoperiod effect on endogenous hormones of alfalfa with different fall-dormancy

由圖6可知，隨著光照時間的遞增，GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA都有依次上升趨勢。各光照處理下，3個比值的峰值都在16 h/d，且變化趨勢明顯。

圖6 光周期對不同秋眠級紫花苜蓿GA3/ABA、IAA/ABA和ZR/ABA的影響Fig.6 Photoperiod effect on GA3/ABA，ZR/ABA and IAA/ABA of alfalfa with different fall-dormancy

3 討論

秋眠是一種特殊的休眠方式，即內(nèi)生性休眠。目前，休眠在生理方面得到廣泛的研究［22-24］，苜?；蚩寺『凸δ芙M學的研究日漸深入［25-28］，但苜蓿休眠的調(diào)控機理研究仍有很多空白。

大量研究表明，植物的休眠受光周期的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。短日照誘導(dǎo)植物的休眠在楊樹(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)、狗木(Cornus sericea)等樹木中得到了證實［29-32］，其中PHYA和PHYB的表達在光信號通路中發(fā)揮著重要作用，擬南芥中96%光誘導(dǎo)的基因是通過PHYA和PHYB來調(diào)節(jié)的［33-34］，短日照條件下，PHYA的超表達抑制休眠誘導(dǎo)，通過改變?nèi)照臻L度能改變其休眠反應(yīng)［30，32］。Kuhn 等［34］的試驗證明，光周期調(diào)控了葡萄葉中PHYA和PHYB mRNA表達量，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了葡萄的休眠，PHYA和PHYB含量在正常生長季節(jié)不穩(wěn)定，一旦被轉(zhuǎn)移至短日照誘導(dǎo)休眠的條件下，不穩(wěn)定的表達現(xiàn)象都停止，取而代之的是表達量均增加［34-35］。王成章等［10］通過研究不同光周期對苜蓿秋眠性的影響結(jié)果表明，秋眠型苜蓿短日照條件下PHYB的蛋白表達量最高，推測其含量多寡程度不同調(diào)控了光周期反應(yīng)，進而誘導(dǎo)了休眠。本實驗結(jié)果顯示，3個不同秋眠類型苜蓿品種基本都是在短日照條件下葉片中的PHYA和PHYB mRNA表達量高，秋眠特征明顯，可能的原因是:苜蓿為長日照植物，短日照為苜蓿生長創(chuàng)造了較強的逆境效應(yīng)，苜蓿為應(yīng)對這種不良的環(huán)境刺激，通過加速PHYA和PHYB合成，誘導(dǎo)苜蓿進入秋眠。尤其短日照條件下1級品種Norseman即秋眠型苜蓿品種PHYB表現(xiàn)最為明顯，合成量也最大，隨著光周期的延長，PHYB的含量直線下降，秋眠型苜蓿PHYB mRNA合成量明顯高于半秋眠型、非秋眠型苜蓿，顯示了PHYA和PHYB可能在苜蓿秋眠性中發(fā)揮了重要作用。

在植物的自然休眠中，內(nèi)源激素是一個十分重要的影響因子，多數(shù)研究認為，內(nèi)源激素參與了休眠的誘導(dǎo)、維持與終止。GA3與ABA在休眠中的作用相反，ABA能促進休眠，GA3有解除休眠的作用，但GA3能促進ZR、IAA的生物合成，且ABA的作用只有在其他內(nèi)源激素的密切配合下才能表現(xiàn)出來［36］。休眠不僅與植物內(nèi)源激素的絕對含量有關(guān)，還與各類激素之間的平衡，特別是促進生長的激素與抑制生長的激素之間的比例及平衡有關(guān)［37］。本試驗測定了IAA、ABA、ZR、GA3的含量，結(jié)果表明，7 h/d光照時間GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA均為最低，可能是短日照條件下苜蓿的生長被抑制和休眠較強的原因;隨著光照時間的延長，GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA依次增大，其中3種秋眠類型苜蓿3種激素比值均以16 h/d最高，可能是長日照條件下苜蓿休眠被解除、生長被促進的原因。

植物的光形態(tài)建成中，在接受光周期信號后，光受體基因通過改變植物內(nèi)源激素的含量進而調(diào)控靶基因發(fā)揮作用［38-44］，ABA、GA3和 IAA 被包含在光形態(tài)建成中。Mazzella等［45］、Seo等［46］證明 PHYB 直接或間接調(diào)控了ABA合成，進而影響擬南芥的休眠;王成章等［10］的研究表明，在短日照條件下，苜蓿的秋眠是通過促進PHYB蛋白的合成進而增加ABA的合成量來實現(xiàn)的，其中秋眠型苜蓿在短日照條件下的PHYB和ABA的合成量顯著高于半秋眠苜蓿和非秋眠苜蓿可能是其秋眠早且強的原因之一。本研究中，短日照條件下苜蓿葉片中PHYA、PHYB mRNA表達量和ABA含量顯著高于長日照與王成章等［10］不同光周期條件下PHYB蛋白水平的表達研究結(jié)果基本一致，進一步說明在不同光周期條件下，光敏色素和植物內(nèi)源激素可能參與了苜蓿的光形態(tài)建成，PHYA和PHYB直接或間接調(diào)控植物內(nèi)源激素GA3、ZR、IAA、ABA的合成，進而調(diào)控了苜蓿的秋眠。

4 結(jié)論

在短日照條件下，ABA和PHYA、PHYB mRNA的表達量或合成量增加，GA3、ZR、IAA的合成量下降，可能PHYA、PHYB在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接影響了內(nèi)源激素GA3、ZR、IAA、ABA的合成，進而調(diào)控了苜蓿的秋眠。

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