黃花草木樨水浸提液中潛在化感物質(zhì)的分離、鑒定

鄔彩霞，劉蘇嬌，趙國琦

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州225009）

黃花草木樨（Melilotusofficinalis）為豆科草木樨屬植物，適應(yīng)能力強，具有很高的生物量產(chǎn)量和固氮能力，能最大限度地減少水土流失和改良土壤［1－2］，也是極好的蜜源和花粉植物［3］；黃花草木樨還可以入藥，它可以作為抗凝血劑（雙香豆素及其衍生物）用于減少手術(shù)后血塊凝結(jié)［3］并用于治療脂肪團［4］。此外，黃花草木樨還具有很強的化感作用，其水浸提液對多花黑麥草（Loliummultiflorum）、婆婆納（Veronicapersica）、早熟禾（Poapratensis）等植物的種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著的抑制作用［5］，其刈割后的殘茬能有效控制當(dāng)季田間雜草［6］，作為綠肥栽培，刈割翻埋后能顯著減少田間雜草，如多年生雜草蒲公英（Taraxacumofficinale）和苦菜（Sonchusarvensis），以及一年生雜草地膚（Kochiascoparia），播娘蒿（Descurainiasophia），俄羅斯薊（Salsolaiberica）和旱雀麥（Bromustectorum）等［7］，或者田間施用黃色草木樨干草粉也能顯著抑制雜草生長［5］，所以，黃花草木樨被認為可以通過間作、翻埋或覆蓋等方式作為天然除草劑來控制田間雜草。

化感物質(zhì)的分離、鑒定和驗證是植物化感作用研究的重要組成部分［8］?；形镔|(zhì)被認為是比化學(xué)除草劑更安全和對環(huán)境友好的生物除草劑，迄今為止，一些化感物質(zhì)已被分離和研究出來以開發(fā)新的天然除草劑［9］。因此，如果能找到草木樨的主效化感物質(zhì)，或許可以開發(fā)成為新型生物除草劑，以減少人類對化學(xué)除草劑的依賴。國內(nèi)外許多學(xué)者很早就開始對草木樨屬植物的化學(xué)成分進行了研究，從中分離出了香豆素、黃酮、酚酸、三萜、皂苷類化合物［10－11］，但都是從藥理特性方面進行分析研究的。然而，到目前為止，關(guān)于黃花草木樨的化感活性物質(zhì)只有少數(shù)報道，Macías等［12－13］分離出一些酚類物質(zhì)和極性化合物，鑒定為黃花草木樨的潛在化感物質(zhì)；鄔彩霞等［14］發(fā)現(xiàn)酚酸類化合物存在于黃花草木樨的水浸提液中，且其含量和水浸提液的化感作用強度相關(guān)。但黃花草木樨的主要化感物質(zhì)，或者作用最強的化感物質(zhì)仍然未知。本研究借鑒了Takemura等［15］的方法，擬采用有機溶劑萃取、層析、色譜分離、GC－MS等方法將黃花草木樨水浸提液中的主要化感物質(zhì)進行提取、分離、鑒定，為黃花草木樨化感作用的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 植物材料與試劑

以黃花草木樨為供體植物，2011年10月25日播種于江蘇省揚州大學(xué)試驗田，2012年4月中旬于花期采集新鮮植株；以多花黑麥草為受體植物；種子均購于北京正道生態(tài)科技有限公司。

分析純：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮。色譜純：甲醇、乙腈、丙酮。均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 黃花草木樨水浸提液的制備 取黃花草木樨新鮮植株100g，剪成2cm長，用1000mL蒸餾水4℃浸提72h，獲得10%（w／v）的水浸提液。水浸提液經(jīng)過二重過濾：第一重用定量濾紙過濾；第二重用濾元單位為0．45 μm的濾膜過濾。得到不含微生物的水浸提液，置于4℃冷藏備用。

1．2．2 黃花草木樨水浸提液不同極性有機相萃取 主要化感物質(zhì)的分離參考Bertin等［16］的方法，并適當(dāng)加以改進。將制備好的黃花草木樨水浸提液10L用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45℃，－0．1MPa）減壓濃縮，濃縮至1L。再用3種極性遞增的有機試劑（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）依次萃取濃縮液，每種有機溶劑萃取3次，合并萃取液，除水（無水Na2SO4過夜處理）后濃縮、低溫干燥后收集各組分萃取物，稱重，并配制水溶液做化感活性的生物檢測。

1．2．3 化感物質(zhì)生物活性的測定 將50粒供體植物多花黑麥草種子用1%的NaClO浸泡30min后，播入鋪有石英砂、直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，加入10mL化感物質(zhì)處理液，播種3和6d后分別計算種子的發(fā)芽率，播種6d后從每個培養(yǎng)皿中隨機取10株幼苗，測定其根長和苗長，并測定這10株幼苗的干重。

1．2．4 黃花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取物中主要化感物質(zhì)的分離和鑒定 對各萃取物進行生物活性的測定后，將活性較強的乙酸乙酯萃取物用硅膠柱（硅膠：300～400目；層析柱：直徑30mm，高度450mm，口徑24 mm）進行層析分離。采用濕法裝柱，將300～400目柱層析硅膠裝入層析柱內(nèi)，并用空氣泵壓實，排凈空氣。用薄層層析色譜法以及紫外分析儀不斷摸索得到的洗脫劑（乙酸乙酯∶石油醚＝2∶3）進行洗脫，經(jīng)薄層層析結(jié)合紫外分析儀分別收集顯色的成分，將黃花草木樨水浸提液的乙酸乙酯萃取物分出上層、中層和下層3層混合物，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后收集，取部分配制水溶液進行生物檢測，部分經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀確定各混合物中的主要成分。

1．2．5 化感物質(zhì)檢測的儀器條件 氣質(zhì)聯(lián)用儀（Trace DSQII，美國 Thermo Fisher Scientifc）色譜條件。色譜柱：Stabilwas－DA 30mm×0．25mm×0．32μm石英毛細管柱。起始溫度50℃，保持3min，以10℃／min升溫至300℃，以20℃／min升溫至330℃。進樣量1μL。

1．3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

采用SPSS（Ver．16．0）對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析以及差異顯著性分析。采用Excel 2003進行作圖。

抑制率IR（inhibition rate，%）的計算參考Chung等［17］的方法，計算公式如下：

當(dāng)IR＞0時，表示為抑制作用；當(dāng)IR＜0時，表示為促進作用。IR的絕對值代表作用強度的大小。

2 結(jié)果與分析

2．1 黃花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取物對多花黑麥草幼苗生長的影響

圖1 乙酸乙酯各層提取物對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制率Fig．1 Inhibition rate of Italian ryegrass seed germination and seedling growth treated by ethyl acetate extract

如圖1，黃花草木樨水浸提液濃縮分離后的乙酸乙酯相及其分層后的3層混合物對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長均具有一定的化感作用，其中，乙酸乙酯相及其上層混合物處理與對照相比均顯著抑制了多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的各項指標(biāo)（P＜0．05）。乙酸乙酯相處理的抑制作用均為最強，對3d發(fā)芽率、6d發(fā)芽率、幼苗根長、莖長和苗干重的抑制率分別為83．02%，20．14%，91．06%，40．22%，67．50%，且顯著高于其分離得到的上、中、下層3層混合物的處理（P＜0．05）；上層混合物處理對多花黑麥草的抑制率次之，對3d發(fā)芽率、6d發(fā)芽率、幼苗根長、莖長和苗干重分別為45．99%，6．25%，81．89%，14．88%和49．16%；中層混合物處理則只對多花黑麥草種子3d發(fā)芽率和幼苗根長具有顯著的抑制作用（P＜0．05）；下層混合物處理對多花黑麥草的種子萌發(fā)和幼苗生長則表現(xiàn)出明顯的促進作用，對多花黑麥草種子3d發(fā)芽率、根長、莖長、干重的抑制率均為負值，分別為－11．11%，－2．74%，－9．27%和－0．83%，且與其他處理之間差異顯著（P＜0．05）。

2．2 黃花草木樨水浸提液乙酸乙酯提取相中化感物質(zhì)的檢測

2．2．1 乙酸乙酯相潛在化感物質(zhì)的檢測 采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（GC－MS）分析乙酸乙酯相中潛在的化感物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測到約25種物質(zhì)，其中的12種相對含量較高，具體鑒定見表1。其中，相對含量最高的物質(zhì)出峰時間在14．51min，經(jīng)鑒定為香豆素，其相對含量遠高于其他物質(zhì)（圖2）。

圖2 乙酸乙酯相的GC－MS圖Fig．2 GC－MS chromatogram of ethyl acetate phase

2．2．2 乙酸乙酯上層潛在化感物質(zhì)的檢測 采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（GC－MS）分析乙酸乙酯上層中潛在的化感物質(zhì)，檢測到23種物質(zhì)，其中的5種相對含量較高，具體鑒定結(jié)果見表2，其中主要物質(zhì)的峰出現(xiàn)在14．55min，經(jīng)鑒定為香豆素，其相對含量遠高于上層其他物質(zhì)（圖3）。

2．2．3 乙酸乙酯中層潛在化感物質(zhì)的檢測 采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（GC－MS）分析乙酸乙酯中層中潛在的化感物質(zhì)，結(jié)果檢測到25中化學(xué)物質(zhì)，其中的12種相對含量較高（圖4），具體鑒定結(jié)果見表3，其中幾種主要物質(zhì)鑒定分別為二溴三甲基環(huán)丙烷、6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethy－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol、2，6－二叔丁基對甲酚、甲基環(huán)戊醇等。

表1 乙酸乙酯相中的主要化學(xué)成分Table 1 The main chemical composition of ethyl acetate phase

圖3 乙酸乙酯相分離出的上層物質(zhì)的GC－MS圖Fig．3 GC－MS chromatogram of upper layer stratified from ethyl acetate phase

表2 乙酸乙酯相分離出的上層的主要化學(xué)成分Table 2 The main chemical composition of upper layer stratified from ethyl acetate phase

圖4 乙酸乙酯相分離出的中層物質(zhì)的GC－MS圖Fig．4 GC－MS chromatogram of middle layer stratified from ethyl acetate phase

表3 乙酸乙酯相分離出的中層中主要化學(xué)成分Table 3 The main chemical composition of the middle layer stratified from ethyl acetate phase

2．2．4 乙酸乙酯下層潛在化感物質(zhì)的檢測 采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（GC－MS）分析乙酸乙酯下層中潛在的化感物質(zhì)，結(jié)果檢測到25種化學(xué)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中的11種物質(zhì)相對含量較高（圖5），具體鑒定見表4。其中幾種主要物質(zhì)鑒定分別為二溴三甲基環(huán)丙烷、甲基環(huán)戊醇、環(huán)己基溴化膦等。

3 討論

本研究提取、分離、鑒定了黃花草木樨水浸提液中潛在的化感物質(zhì)。很多關(guān)于化感物質(zhì)的提取、分離、鑒定的研究中［18－19］，都采用有機溶劑直接浸泡植物體來提取更多的化感物質(zhì)，此類方法盡管可以盡可能的提高植株中化感物質(zhì)的提取量，但可能出現(xiàn)的情況是提取到的物質(zhì)并不是植物在自然條件下能釋放到周圍環(huán)境中并表現(xiàn)出化感活性的物質(zhì)，即不能稱之為化感物質(zhì)。在自然條件下，活體植物是通過根系分泌、莖葉淋溶、揮發(fā)及殘株腐解等形式向環(huán)境釋放某些化學(xué)物質(zhì)，所以，采用水浸提植物體中的化感物質(zhì)，提取到的活性物質(zhì)更能真實反映植物體的化感物質(zhì)組成［20］。因此，本文采用了水浸提液為分析黃花草木樨化感物質(zhì)的基礎(chǔ)條件。

圖5 乙酸乙酯相分離出的下層物質(zhì)的GC－MS圖Fig．5 GC－MS chromatogram of lower layer stratified from ethyl acetate phase

表4 乙酸乙酯相分離出的下層的主要化學(xué)成分Table 4 The main chemical composition of lower layer stratified from ethyl acetate phase

化感物質(zhì)的分離純化大多采用的是色譜分離法，其原理是利用不同物質(zhì)在固定相和流動相這兩相中不同的平衡分配和吸附系數(shù)進行分離純化［21］。色譜分離法的種類很多，在化感活性物質(zhì)的分離純化過程中主要應(yīng)用的是：用于初步分離的柱色譜分離法、用于檢測的薄層色譜法（TLC）和用來純化的制備色譜儀（制備TLC或HPLC）。在化感物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定方面主要依據(jù)的是：熔點、紅外光譜、紫外光譜、液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC－MS）［22］、毛細管電泳（CE）和核磁共振譜（NMR）等參數(shù)來判斷物質(zhì)中存在的功能團、共軛體系、分子量、分子結(jié)構(gòu)以及H原子和C原子在分子中的結(jié)合方式等信息，從而確定化感物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，最后再根據(jù)測定出的結(jié)構(gòu)用已知的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)對照，最終確定這種物質(zhì)［8］。本文即采用了層析柱和薄層色譜分析法，分離了黃花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取相中的潛在化感物質(zhì)，并采用GC－MS技術(shù)檢測、鑒定了其中相對含量較高的主要成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯相中含有的物質(zhì)種類非常復(fù)雜，這些物質(zhì)主要屬于8類化合物，分別為香豆素類（香豆素和3，4－二氫香豆素）、醇類［1－甲基環(huán)戊醇，3－甲基環(huán)戊醇，6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethyl－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol，叔丁基過氧化氫］、酯類（磷酸三甲酯）、烷烴類（反式－3，4－環(huán)氧辛烷，2－溴－1，1，3－三甲基環(huán)丙烷和正十一烷）、酮類（二氫苯并吡喃酮）、苯酚類（2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚）、酰胺類（芥酸酰胺，油酸酰胺）和磷化氫類（環(huán)己基膦二溴化物）。其中含量最高的物質(zhì)為香豆素，其次為6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethyl－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol、二氫苯并吡喃酮、2，6－二叔丁基對甲酚、二溴三甲基環(huán)丙烷、磷酸三甲酯等物質(zhì)；將乙酸乙酯相進一步分離后，得到3層混合物：上層、中層、下層，經(jīng)過GC－MS檢測發(fā)現(xiàn)上層混合物中相對含量較高的主要為香豆素，中層混合物中含量相對較高的有二溴三甲基環(huán)丙烷、6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethy－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol、2，6－二叔丁基對甲酚、甲基環(huán)戊醇等物質(zhì)；下層混合物中含量相對較高的有二溴三甲基環(huán)丙烷、甲基環(huán)戊醇、環(huán)己基溴化膦等物質(zhì)。由于乙酸乙酯相中的化學(xué)成分非常復(fù)雜，在本文中只鑒定了那些相對含量較高的物質(zhì)，而乙酸乙酯相分離后3層混合物的檢測到的一些相對含量較高的成分，在未分離純化前，即在乙酸乙酯相中的含量非常微小，所以，在乙酸乙酯相的成分分析中沒有標(biāo)出這些物質(zhì)，也是結(jié)果中（表1～表4）乙酸乙酯相分離前后分析出的主要成分有差異的原因。但是，總體來看，乙酸乙酯相分離前和分離后，相對含量較高的物質(zhì)是一致的。

檢測出的物質(zhì)中，香豆素為已報道的具有較強化感活性的化感物質(zhì)［23－24］，香豆素不僅可以抑制其他植物生長［23］，還具有殺蟲［25］、抗菌［26］等生物活性，被認為是非常有應(yīng)用前景的化感物質(zhì)［24］。也有研究［27－29］發(fā)現(xiàn)2，6－二叔丁基對甲酚為一些植物的化感物質(zhì)，但在生物檢測中，其化感活性并不是很強。檢測出的其他物質(zhì)多數(shù)均為新發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，香豆素在整個乙酸乙酯相以及乙酸乙酯上層提取物中的相對含量均遠高于其他物質(zhì)（圖2，圖3）；生物檢測結(jié)果（圖1）顯示，乙酸乙酯相處理對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的化感抑制作用最強，其處理的多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的各項指標(biāo)抑制率均顯著高于相同濃度的乙酸乙酯上層、中層和下層提取物處理；而上層混合物處理對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用又明顯高于中層和下層提取液。由以上結(jié)果或許可以推測，香豆素為乙酸乙酯提取液中主要的化感物質(zhì)之一，其在黃花草木樨的化感抑草作用中可能扮演重要角色。Takemura等［15］將強化感植物墨西哥丁香（Gliricidiasepium）的浸提液進行分離、鑒定時也發(fā)現(xiàn)，香豆素含量最高的組分對生菜（Lactucasativa）的化感抑制作用最強，且經(jīng)過分析浸提液中香豆素的含量及其對綜合化感效應(yīng)的貢獻，發(fā)現(xiàn)香豆素為其浸提液化感作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用的物質(zhì)，即為其主效化感物質(zhì)。此外，6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethyl－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol、二氫苯并吡喃酮等新發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)在乙酸乙酯相和乙酸乙酯中層混合物中的含量也相對較高，而乙酸乙酯中層混合物處理的多花黑麥草種子萌發(fā)或幼苗生長也受到顯著的抑制作用，因此，這幾種物質(zhì)也可能具有較高的化感抑草潛力，在下一步的研究中，將用這幾種物質(zhì)的化學(xué)純品進行生物檢測驗證，以進一步明確黃花草木樨的主效化感物質(zhì)。

乙酸乙酯相對多花黑麥草的抑制作用顯著高于分離出來的每一層物質(zhì)，這一結(jié)果還說明乙酸乙酯相中的化感物質(zhì)之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)。植物水浸提液提取物所表現(xiàn)出來的化感活性往往不是單一物質(zhì)在發(fā)揮作用，而是幾個或幾類化合物綜合作用的結(jié)果，所以化感效應(yīng)的強弱不僅取決于化學(xué)物質(zhì)的種類和濃度，更取決于不同化感物質(zhì)之間的拮抗和協(xié)同作用。

4 結(jié)論

黃花草木樨水浸提液的乙酸乙酯相是化感抑制活性較高的組分，其中含有的物質(zhì)種類非常復(fù)雜，其中相對含量最高的物質(zhì)為香豆素，還包括二氫苯并吡喃酮、2，6－二叔丁基對甲酚6－（3－Hydroxy－but－1－enyl）－1，5，5－trimethyl－7－oxabicyclo［4，1，0］heptan－2－ol等相對含量較高的化合物；將乙酸乙酯相進一步分離得到的3層混合物，上層混合物的化感活性最強，且其中相對含量最高的物質(zhì)仍然為香豆素，推測香豆素可能是黃花草木樨水浸提液中主要的化感物質(zhì)。

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