手性鐵、鎳席夫堿配合物的合成、結構及其與DNA相互作用研究

包菲菲 徐新新 周 文 龐春燕 奚賽飛 顧志國＊,,2 李在均

(1江南大學化學與材料工程學院，無錫214122)

(2食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，無錫214122)

0 引 言

由于DNA在復制和轉錄過程中起著非常重要的作用，它已經(jīng)成為研究抗菌、抗癌、抗病毒等藥物的主要目標[1]。核酸與藥物結合能夠治療種類較多的疾病如：癌癥，瘧疾，艾滋病以及由細菌、病毒、真菌等引起的疾病[2]。小分子過渡金屬配合物與DNA的作用在核酸化學領域已經(jīng)引起廣泛的關注，其中研究較多的是含有共軛芳香雜環(huán)配體的八面體過渡金屬配合物[3-11]，尤其是作為DNA分子結構探針，DNA光轉換材料，DNA裂解試劑以及抗癌藥物中的潛在應用。CT-DNA本身所具有的右手螺旋性導致其與不同手性化合物作用時有一定的手性選擇性。DNA的手性識別對于藥物設計和研究DNA構型的結構探針有著極其重要的意義[12]。例如一種薩力多胺藥物，它的R型異構體有藥物活性，而S型異構體會導致先天性缺陷癥[13]。手性化合物能夠通過與DNA的立體選擇性結合而提高藥物的吸收率[14]。因此，手性化合物選擇性識別DNA的研究引起了學者們的極大興趣[15]。

早期對于手性配合物與DNA的作用研究較多的是以鄰菲咯啉(phen)為配體的Ru，Zn，Co等金屬的八面體手性配合物[16-18]。如[Ru(phen)3]2+配合物，它的Δ構型是在DNA的大溝處以插入方式與DNA的結合方式，而構型則在DNA的小溝與DNA發(fā)生靜電結合[17]。最近，一種單核稀土金屬手性螺旋配合物被報道對B型DNA有很好的手性選擇能力，與M型異構體相比，其P型異構體對poly(dG-dC)2(GCDNA)和 poly(dA-dT)2(AT-DNA)這兩種 B型 DNA有更好的穩(wěn)定效果，但對于非B型的雙螺旋DNA和四鏈體DNA均沒有作用效果[19]。文獻報道了一系列手性雙金屬三螺旋配合物具有與不同拓撲結構DNA選擇性識別作用的能力[20]。如 [Ni2L3]4+-P和[Ni2L3]4+-M配合物在無陽離子存在的情況下與人體端粒DNA作用，P型異構體能夠誘導人體端粒DNA形成G-四鏈體結構，而M型異構體卻無法誘導DNA形成G-四鏈體結構[21]。與已報道手性有機小分子的DNA結合藥物相比，手性金屬配合物與DNA相互作用的研究還處于初級階段，更多的手性配合物藥物還有待于進一步開發(fā)。

本文合成了4對含手性席夫堿配體的單核鐵、鎳配合物(圖1)，并通過紅外光譜(IR)、核磁共振(1H NMR)、元素分析(EA)、X-射線單晶衍射對配合物的結構進行了表征。通過紫外吸收光譜、熒光猝滅光譜、圓二色譜等光譜分析法對4對單核手性配合物與CT-DNA的作用進行了研究，并分析了不同配體、不同金屬中心、不同手性配合物之間與DNA作用的差異。

1 實驗部分

1.1 配合物的X-射線單晶衍射

1R-Fe，1R-Ni，1S-Ni以及 2R-Fe 的單晶衍射測試是在296(2)K溫度下，使用APEXⅡDUO CCD衍射儀測定。采用石墨單色化的Mo Kα射線 (λ=0.071 073 nm)，以ω掃描方式收集數(shù)據(jù)。衍射數(shù)據(jù)和晶胞參數(shù)用SAINT程序[22]進行還原和精修，并用Bruker公司提供的SADABS程序進行吸收校正[23]。晶體結構用SHELXS-97程序采用直接法解出并用SHELXL-97程序?qū)λ蟹菤湓幼鴺撕蜏囟纫蜃舆M行了全矩陣最小二乘法精修[24]。

圖1 配合物 1R-Fe、1R-Ni、1S-Fe、1S-Ni(a)和 2R-Fe、2R-Ni、2S-Fe、2S-Ni(b)的分子結構圖Fig.1 Molecular structures of the complexes 1R-Fe,1R-Ni,1S-Fe,1S-Ni(a)and 2R-Fe,2R-Ni,2S-Fe,2S-Ni(b)

1.2 紫外光譜滴定

在雙光束紫外分光光度計中，于參比池和樣品池中均加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液 (5 mmol·L-1，50 mmol·L-1NaCl，pH=7.2)，并掃基線。 待基線穩(wěn)定后用微量注射器向樣品池中加入一定量體積的配合物溶液，使得鐵配合物和鎳配合物的終濃度分別為30 和 48 μmol·L-1，記錄配合物的紫外吸收光譜。 然后每次向兩個比色皿中分別加入等量的DNA溶液(以扣除樣品池中 DNA 的吸收)，在 1R-Fe、1S-Fe、1RNi、1S-Ni配合物中加入 0～126 μmol·L-1的 DNA，在2R-Fe、2S-Fe、2R-Ni、2S-Ni中不斷加入 0～120 μmol·L-1的DNA。每次加入DNA，混勻等待5 min后，記錄相應的紫外光譜。觀察各物質(zhì)紫外光譜圖的變化。

1.3 熒光猝滅光譜滴定

在熒光分光光度計中，向熒光比色皿中加入3 mL 樣品(含 cDNA=80 μmol·L-1，cEB=4 μmol·L-1)并掃描DNA-EB的熒光譜圖。隨后用微量注射器不斷向DNA-EB溶液中加入配合物溶液，使得配合物在比色皿中的終濃度也隨之不斷增加((1R-Fe、1S-Fe(0～35 μmol·L-1)，1R-Ni、1S-Ni(0～152 μmol·L-1)，2R-Fe、2S-Fe(0～36 μmol·L-1)，2R-Ni、2S-Ni(0～105.6 μmol·L-1))，混勻等待 5 min后，分別掃描540～700 nm范圍內(nèi)的譜圖。熒光激發(fā)波長設置在528 nm處，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫都設置為5 nm。觀察熒光譜圖變化。

1.4 圓二色譜滴定

在圓二色譜實驗中，向比色皿中加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液(5 mmol·L-1，50 mmol·L-1NaCl，pH=7.2)，扣除基線后再在比色皿中加入配合物，使得各配合物的濃度保持在30 μmol·L-1并掃描譜圖。在各個配合物中不斷加入 0～126 μmol·L-1的 DNA，混勻等待5 min后，掃描相應的圓二色譜圖。每個CD譜圖均扣除DNA的圓二吸收峰，所得到的圓二色譜純粹表達了在加入DNA后配合物的變化。

2 結果與討論

2.1 配合物結構表征

利用紅外光譜、核磁共振氫譜、元素分析等手段對 配 合 物 1R-Fe、1S-Fe、1R-Ni、1S-Ni、2R-Fe、2SFe、2R-Ni、2S-Ni結構進行了表征，詳細表征數(shù)據(jù)見Supporting Information。

圖2 配合物1R-Ni(a)和1S-Ni(b)的晶體結構圖Fig.2 Crystal structures of the complexes 1R-Ni(a)and 1S-Ni(b)

圖3 配合物2R-Fe的晶體結構圖Fig.3 Crystal structure of the complex 2R-Fe

為了直觀說明手性席夫堿配合物的結構，我們測定了 1R-Fe、1R-Ni、1S-Ni以及 2R-Fe 這 4 種配合物的X-射線單晶結構，晶體結構信息和鍵長鍵角見表S1和S2。4種配合物的晶體結構見圖2、3及S1，為了簡明起見，圖中省略了ClO4-陰離子、溶劑乙腈分子以及所有的氫原子。配合物1R-Fe、1R-Ni與1R-Ni、1S-Ni同構，結晶于P213手性空間群，其中1R-Ni、1S-Ni為一對手性對映體。如圖2和S1所示，中心金屬離子FeII、NiII與3個相同二齒配體L1提供的6個氮原子配位形成的變形MN6八面體配位環(huán)境。1R-Ni，1S-Ni和1R-Fe的M-N平均鍵長分別為 0.211 7(5)，0.211 8(0)和 0.199 1(5)nm。 3 個不對稱配體中的吡啶環(huán)上的氮原子互相垂直，表明此類配體與鐵、鎳配位形成了一種fac構型，同時R型配體誘導配合物形成fac-構型，而S型配體誘導配合物形成fac-構型。每個配體上的苯環(huán)與相鄰配體上的吡啶環(huán)相互堆積形成了分子內(nèi)的π-π相互作用，配體的手性通過配位作用將光學活性傳遞到了金屬中心，使整個配合物具有單一的手性構型。

三齒手性配體L2與FeII、NiII離子反應均形成2∶1的同構配合物。以2R-Fe為例來說明它們的結構。如圖3所示，2R-Fe結晶于P212121手性空間群，分子內(nèi)的2個配體以十字交叉的方式與中心FeII配位，形成FeN6扭曲八面體結構。Fe-N平均鍵長分別為0.197 3(8)nm，與典型的低自旋態(tài)的鍵長一致[25]。其中一個L2配體中的2個苯環(huán)與分子中另一個L2配體中的吡啶環(huán)發(fā)生π-π堆積作用。而另一配體上的其中1個苯環(huán)與相鄰配體上的吡啶環(huán)相互堆積形成了分子內(nèi)的π-π相互作用。這些分子內(nèi)的堆積作用使得2R-Fe結構更加緊湊，從而穩(wěn)定了整個分子。

2.2 紫外滴定光譜分析

在與DNA作用的研究中，紫外-可見光譜是最有用的檢測手段[26]，當配合物與DNA發(fā)生作用時，配合物的紫外光譜會表現(xiàn)出紅移及減色，且紅移及減色的強度與配合物-DNA的作用強度相關。4對配合物中含有的芳香環(huán)以及金屬中心與配體之間的電子躍遷能夠在紫外可見區(qū)域形成強烈的電子吸收譜帶。在無DNA與有DNA存在時2R-Fe(30 μmol·L-1)、2S-Fe(30 μmol·L-1)、2R-Ni(48 μmol·L-1)、2S-Ni(48 μmol·L-1)的紫外光譜如圖 4 所示，隨著每次加入等量的 DNA(0～120 μmol·L-1)，配合物在 205 nm左右的吸光度均出現(xiàn)明顯的下降，各配合物的紫外譜圖中的減色率及紅移見表1，配合物2R-Fe、2S-Fe和2R-Ni、2S-Ni均出現(xiàn)較為明顯的紅移及減色現(xiàn)象，且含鐵金屬中心的配合物的紅移程度強于相應的鎳配合物。 而1R-Fe、1S-Fe和1R-Ni、1S-Ni也出現(xiàn)減色但未出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象(圖S2-S3)，初步說明4對手性配合物與DNA均能有效的作用，且8個物質(zhì)與DNA的結合能力存在著差異。利用紫外光譜數(shù)據(jù)，可以用以下公式計算各物質(zhì)與DNA的結合常數(shù)Kb[27]：

配合物均能與DNA發(fā)生不同強度的結合，結合穩(wěn)定常數(shù)從 4.41×103L·mol-1到 1.88×104L·mol-1。這4對手性配合物的DNA結合常數(shù)與經(jīng)典溝面結合試劑 DAPI的 DNA 結合常數(shù)(8.90×103L·mol-1)相當[28]。比較4對配合物的結合常數(shù)可知，不同手性的配合物與DNA的作用表現(xiàn)出差異，S型配體形成的配合物與DNA作用的強度比R型配體形成的配合物強。這可能是由于S型配體形成的配合物相對于R型配體形成的配合物與右手螺旋的DNA溝面構型更加匹配，能夠更加深入的結合在DNA的溝面處，且較好的卡在DNA的溝槽中而不容易發(fā)生偏移。S型配體形成的配合物具有相對較大的DNA結合能力，這與文獻報道的結果相吻合[15h][29]。從表1中結合常數(shù)也表明金屬中心為鐵的配合物表現(xiàn)出比相應的鎳配合物更強的DNA作用力，不同金屬中心影響配合物與DNA的作用強度[30]。除此之外，含三齒配體的配合物與DNA作用的強度比相應含二齒配體的配合物強，這可能是由于含三齒配體的配合物與DNA作用時能形成二聚體結合在DNA的溝面處而增強了結合作用力[31]。另外也可能是由于含三齒配體的配合物的結構更加緊湊容易進入DNA的溝槽，而含二齒配體的配合物中的苯環(huán)較為向外延伸，在與DNA發(fā)生溝面結合的時候有更大的位阻。

表1 4對手性配合物與DNA相互作用的紫外滴定光譜數(shù)據(jù)Tab.1 Data for UV-Vis titration of the four pairs of chiral complexes binding to DNA

2.3 熒光猝滅實驗分析

EB是一種具有平面芳環(huán)結構的小分子，與DNA作用時插入DNA小溝處的堿基對中而增強了熒光強度，廣泛應用于光譜探針[32]。當EB從DNA的雙螺旋結構中游離出來時，熒光會顯著降低。因此，利用熒光猝滅實驗以進一步研究配合物與DNA之間 的 相 互 作 用 。 DNA-EB(cDNA=80 μmol·L-1，cEB=4 μmol·L-1)體系在存在 2R-Fe、2S-Fe(0～36 μmol·L-1)以及 2R-Ni、2S-Ni(0～105.6 μmol·L-1)時的熒光光譜如圖5所示，其余3對手性配合物的熒光光譜見圖S4和S5，當配合物與DNA發(fā)生作用時，DNA-EB體系在600 nm附近的熒光強度逐漸降低，這可能是由于配合物與DNA發(fā)生溝面結合，從而配合物與EB對DNA競爭結合，配合物對DNA的電中和作用使得結合配合物部分的DNA的結構發(fā)生松散和蜷曲，從而使得原本插入在堿基對之間的EB游離于水溶液中，這一過程影響了EB的結合穩(wěn)定常數(shù)[33]。隨著加入配合物的增多，與DNA結合的EB逐漸減少，熒光強度也隨之不斷降低。比較8個配合物的熒光譜圖變化可知，當體系的熒光強度下降到50%左右時，所需的配合物濃度不同，2R-Fe、2S-Fe的所需量比其他幾種配合物都要小(28 μmol·L-1)。在EB和DNA的濃度比為0.05時可根據(jù)Stern-Volmer方程來計算出各個配合物的Stern-Volmer常數(shù)K值[13]。

圖5 在DNA-EB不斷加入配合物2R-Fe、2S-Fe、2R-Ni、2S-Ni后的熒光光譜圖Fig.5 Emission spectra of DNA-EB with increasing concentration of 2R-Fe,2S-Fe,2R-Ni,2S-Ni

表2 4對手性配合物與DNA相互作用的熒光猝滅光譜數(shù)據(jù)Table 2 Data for the fluorescence quenching titration of the four pairs of chiral complexes binding to DNA

其中，式中I0和I分別表示未加配合物和加入配合物后體系的熒光強度，r=ccomplex/cDNA。根據(jù)此公式得到的Stern-Volmer常數(shù)K見表2，K值越大的配合物，光譜的減色效應越明顯，達到50%的減色率時所需要的配合物量越少，其與DNA的結合能力越強。為了進一步證明配合物與DNA的結合性能及其差異，可以通過公式KEBcEB=Kappccomplex計算得到配合物與DNA鍵合的表觀結合常數(shù)，直觀看出配合物與DNA的作用強度，式中Kapp是配合物與DNA結合的表觀結合常數(shù)，KEB是EB與DNA的結合常數(shù)，本實驗中 KEB=1.3×106L·mol-1[34]。 ccomplex是熒光強度降至原來的 50%時配合物的濃度，cEB=4 μmol·L-1。 計算各物質(zhì)的結合常數(shù)如表2所示，從表中所列各個配合物的Kapp值可知，當與DNA結合的EB分子有一半被配合物擠出DNA螺旋結構時，配合物2RFe、2S-Fe具有較大的表觀結合常數(shù)分別為1.63×105、1.86×105L·mol-1。由 Stern-Volmer常數(shù)及表觀結合常數(shù)可知：(1)不同構型的配合物對CT-DNA識別表現(xiàn)出差異性，S型配體形成的配合物的結合能力優(yōu)于相應R型配體形成的配合物；(2)相同配體的配合物中，不同金屬中心的配合物也具有差異，金屬中心為鐵的配合物表現(xiàn)出比相應的鎳配合物更強的DNA作用力；(3)對比相同金屬中心的配合物可以看出，含配體L2的配合物與DNA的結合強度大于相應含配體L1的配合物。所得結果與紫外光譜滴定得到的結論較為吻合。

圖6 配合物隨DNA濃度增加的圓二色譜圖Fig.6 CD spectral profiles of complexes with increasing DNA concentration

2.4 圓二色譜滴定分析

由于圓二色譜對于左右圓偏振光的吸收不同，CD光譜對溶液中的不對稱結構非常敏感。手性被測物質(zhì)結構受到干擾時能夠在其圓二信號中表現(xiàn)出來，變化越明顯說明其結構受到的干擾越強。如圖6所 示 ，1R-Fe 和 1S-Fe，1R-Ni、1S-Ni，2R-Fe、2S-Fe，2R-Ni、2S-Ni(30 μmol·L-1)的圓二色譜峰均互為鏡面關系，表明它們互為對映異構體。隨著DNA溶液的不斷加入(0～126 μmol·L-1)，各個配合物的圓二色譜峰均表現(xiàn)出不同程度的變化。由所得到的色譜數(shù)據(jù)計算物質(zhì)在最大出峰位置的減色率可知：1R-Fe和1S-Fe在310 nm處的減色率分別為9.41%、13.1%，1R-Ni和1S-Ni的減色率分別為8.19%、9.55%；2RNi、2S-Ni的減色率分別為 21.94%、34.18%；2R-Fe和2S-Fe在相同波長的減色率分別為15.82%，44.91%。而比較這2對異構體的減色率表明不同手性的配合物與DNA的作用強度存在差異，S型異構體形成的配合物比相應R型異構體形成的配合物與DNA有更強的結合能力。除此之外，含鐵金屬中心的配合物與DNA的作用強度比相應的含鎳金屬中心的配合物的大。此外，與熒光和紫外的檢測結果一致的是含配體L2的配合物比相應含配體L1的配合物具有更大的CD信號的變化，進一步表明這兩類配合物在DNA結合能力上存在的差異性。

3 結 論

本文合成了2種手性席夫堿配體及其單核手性Fe（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）配合物，并對它們的結構進行了表征。通過系列光譜手段研究配合物與DNA的結果表明，所有配合物均能與DNA發(fā)生不同程度的結合，且可能是通過靜電作用與DNA發(fā)生溝面結合。比較各對手性物質(zhì)的光譜實驗結果可知，具有鐵金屬中心的配合物的DNA鍵合能力強于比相應的鎳配合物強；含三齒配體L2的配合物與DNA的作用比相應的含二齒配體L1的配合物更強；此外，不同手性的配合物與CT-DNA的作用強度也表現(xiàn)出可識別的差異性，S型配體形成的配合物相對于R型配體形成的配合物表現(xiàn)出更強的DNA結合能力。

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