HPLC—ELSD測(cè)定黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量

[摘要]目的 建立測(cè)定黃芪破壁飲片中黃芪甲苷含量的高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)的方法。方法 采用C18柱（5 μm，200 mm×4.6 mm）， 乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度80℃，載氣流速2.7 mL/min。 結(jié)果 該方法回收率99.5%（RSD=2.0%），精密度RSD=1.4%，重復(fù)性RSD=2.5%，黃芪甲苷在（1.2913～10.330）μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.9998）。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，可作為黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。

[關(guān)鍵詞] 黃芪破壁飲片；黃芪甲苷；HPLC-ELSD；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）17-0095-02

黃芪是一味常用中藥材，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、生津養(yǎng)血之功效，用于氣虛乏力、食少便溏、氣虛水腫等病癥。黃芪破壁飲片是一種新型飲片，采用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)，將黃芪飲片粉碎成細(xì)胞破壁粉體，再經(jīng)制粒加工成均勻一致的原飲片全成分的均勻干燥顆粒狀飲片。本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取方法對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明本方法可作為黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。

1儀器與試藥

儀器： Agilent 1100高效液相色譜儀；檢測(cè)器：Alltech 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱：Ecosil C18（5 μm，200 mm×4.6 mm）、Dikma Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×200 mm）、Wondasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。天平：Precisa XT200A電子天平、Sartorius LA230S電子天平、Sartorius ME235S 電子天平。

試劑：甲醇、氫氧化鉀、乙醇、正丁醇、氫氧化鈉、氨水等均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

黃芪破壁飲片（中山中智中藥飲片有限公司，090401等10批）；黃芪甲苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110781-200613）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.1.1流動(dòng)相的選擇 參考《中國(guó)藥典》2010版一部“黃芪”含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相，以乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相，等度洗脫。

2.1.2色譜柱的選擇 曾試用Ecosil C18、Merck C18、Thermo ODS Hypersil C18等多種品牌的色譜柱，結(jié)果各色譜柱所得待測(cè)成分色譜峰峰形好，分離理想。本試驗(yàn)采用Ecosil C18色譜柱。

2.1.3提取方法的選擇 提取方法一：取本品約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過(guò)夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[1]。提取方法二：取本品約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液充分洗滌2次，每次30 mL，棄去堿液，正丁醇液用水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[2]。提取方法三：取本品約1g，精密稱定，置錐形瓶中，加入2%氫氧化鉀甲醇溶液50 mL，加熱回流2 h，放冷，過(guò)濾，用少量甲醇洗滌濾渣及容器，合并洗滌液與濾液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水30 mL洗滌，棄去水層，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。提取方法四：取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL， 1%氫氧化鈉溶液5 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)，濾渣用甲醇適量洗滌，合并濾液減壓回收至干， 殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[3]。

在試驗(yàn)中選用不同的提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明方法三中黃芪甲苷的峰面積最高，且方法較簡(jiǎn)便，故供試品溶液的制備方法選擇方法三作為提取方法[4]。比較結(jié)果見(jiàn)表1。

3方法學(xué)驗(yàn)證

3.1加樣回收試驗(yàn)

黃芪甲苷對(duì)照品回收溶液的制備：精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品（中檢所，批號(hào)110781～200613）0.01578 g，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對(duì)照品溶液（0.6312 mg/mL）。

供試品溶液的制備：取已知含量的黃芪破壁飲片（批號(hào)090401）6份，每份0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液2.5 mL，按供試品溶液制備方法制備。見(jiàn)表2。

3.2精密度試驗(yàn)

3.2.1儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液，在相同的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果RSD%為1.4%，儀器精密度良好。

3.2.2重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃芪破壁飲片（090401），取6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3線性關(guān)系

分別精密吸取0.5165 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀中，所得線性關(guān)系數(shù)據(jù)（表4）以對(duì)照品濃度（μg）的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪圖得直線，回歸方程為Y = 1.71212X +6.72130，r = 0.99987，表明黃芪甲苷進(jìn)樣量在（1.2913 ～10.3300）μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.4耐用性考察

3.4.1被測(cè)溶液的穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液（090401），分別在0、6、18、24 h注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果表明被測(cè)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表5。

3.4.2不同色譜柱的考察 取同一批供試品溶液（090401），采用三條不同牌子的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，考察本品在使用不同牌子C18色譜柱時(shí)，黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果不受結(jié)果影響的程度，結(jié)果見(jiàn)表6。

3.4.3不同儀器的考察 取同一批供試品溶液（090401），采用不同牌子儀器進(jìn)行測(cè)定，考察本品在使用不同牌子儀器時(shí)，黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果不受結(jié)果影響的程度，結(jié)果見(jiàn)表7。

4含量測(cè)定

5討論

破壁飲片作為一種新型飲片受到越來(lái)越多的關(guān)注，它克服了傳統(tǒng)中藥飲片粗、大且需煎煮等諸多缺陷，具有質(zhì)量均勻度高、衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)高、穩(wěn)定性好、形態(tài)美觀、應(yīng)用方便靈活等優(yōu)點(diǎn)。該新型飲片進(jìn)入市場(chǎng)以來(lái)獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益，今后有望進(jìn)入醫(yī)院藥房補(bǔ)充部分傳統(tǒng)飲片的不足。

黃芪飲片經(jīng)超微粉碎破壁后，外觀形態(tài)發(fā)生改變，但飲片本身未發(fā)生質(zhì)的改變，其含量測(cè)定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

本實(shí)驗(yàn)比較了四種提取方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，簡(jiǎn)化了2010版中國(guó)藥典現(xiàn)行的黃芪藥材供試品處理方法。

由于飲片破壁后比表面積增加，理論上黃芪破壁飲片的有效成分較普通飲片溶出速度快，該部分實(shí)驗(yàn)有待后續(xù)完成。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-04-02）