人臍帶間充質(zhì)干細胞向心肌細胞誘導(dǎo)分化并體內(nèi)移植的研究

[摘要] 目的 探討人臍帶間充質(zhì)干細胞（MSCs）經(jīng)5-氮雜胞苷（5aza）誘導(dǎo)后能否向心肌樣細胞分化及誘導(dǎo)后細胞移植到心肌梗死大鼠心臟后能否存活，為心肌細胞的移植探索新的細胞來源。 方法 從人臍帶華爾通氏膠培養(yǎng)出MSCs，檢測人臍帶來源的MSCs的細胞表面標(biāo)記。經(jīng)5aza誘導(dǎo)，采用免疫組化方法及RT-PCR方法檢測誘導(dǎo)后細胞能否表達心肌細胞標(biāo)記物，誘導(dǎo)后細胞經(jīng)5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）標(biāo)記后移植到梗死心肌，觀察移植后細胞能否存活。 結(jié)果 人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)5aza誘導(dǎo)后能表達心肌細胞標(biāo)記物，誘導(dǎo)后細胞移植到心肌梗死模型大鼠心肌后細胞能存活。 結(jié)論 人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)5aza誘導(dǎo)能向心肌樣細胞分化，誘導(dǎo)后細胞移植至體內(nèi)能存活，人臍帶間充質(zhì)干細胞可以作為心肌細胞移植的來源。

[關(guān)鍵詞] 臍帶；干細胞；心肌樣細胞；移植

[中圖分類號] R542.22 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）11-0001-04

心肌梗死無論其發(fā)病率，還是死亡率、致殘率，近年來皆節(jié)節(jié)攀升，嚴重損害社會效益及家庭經(jīng)濟利益。目前，藥物治療、冠脈介入治療、冠脈旁路移植術(shù)為治療本病的一線療法。但上述療法只能優(yōu)化心肌組織供血狀態(tài)，卻無法修復(fù)已經(jīng)壞死的心肌細胞，只能有限改善臨床癥狀和預(yù)后。近年來，干細胞移植研究使人們看到了新的曙光。臍帶間充質(zhì)干細胞特點在于它是一種多能干細胞， 分化潛能項目豐富，其無論生物學(xué)特點還是形態(tài)都類似于骨髓源性MSCs[1-5]。本研究探討人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)能否向心肌樣細胞分化，誘導(dǎo)后心肌樣細胞異體移植至心梗大鼠體內(nèi)，能否存活并分化增殖，為細胞移植療法應(yīng)用于心肌梗死領(lǐng)域提供了干細胞途徑。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取人臍帶1條（經(jīng)家屬同意），去表皮、臍動脈及臍靜脈，取華爾通氏膠（Wharton’s jelly），剪碎為1～2 mm3大小的組織塊作培養(yǎng)用。細胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 g/L）、兩性霉素B（1 mg/L），以充分殺滅細菌。然后配制的DMEM細胞培養(yǎng)液、內(nèi)含10%FBS，將人臍帶華爾通氏膠組織塊放置在該培養(yǎng)液內(nèi)，培養(yǎng)環(huán)境為25 cm2培養(yǎng)瓶，新生細胞貼壁增殖或生長，直至其融合傳代。用0.25%的胰蛋白酶37°C消化3～5 min，終止消化，離心棄上清，繼續(xù)10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2 細胞誘導(dǎo) 臍帶華爾通氏膠來源的MSCs傳代到第3～8代時，進行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)劑選擇5aza，放置該誘導(dǎo)劑且不含F(xiàn)BS的誘導(dǎo)液濃度為10 μmol/L，先進行24 h誘導(dǎo)，而后吸盡誘導(dǎo)液，取代為含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液為培養(yǎng)環(huán)境，繼續(xù)培養(yǎng)至28 d。以倒置相差顯微鏡對誘導(dǎo)期間細胞形態(tài)變化進行精密觀察。

1.2.3 免疫細胞化學(xué)檢測細胞心肌標(biāo)記 行誘導(dǎo)細胞免疫組織化學(xué)染色以troponinT、desmin和troponinI單克隆抗體為染色劑，為期20 min的染色固定以4%多聚甲醇進行， 進行3次PBS沖洗、每次3 min，加入0.1%Triton-X 10 min，3%H2O2時長為20 min以充分滅活內(nèi)源性酶，行3次蒸餾水沖洗，而后進行為期20 min的封閉，材料為5%BSA封閉液，滴加1抗（desmin、troponinT、troponinI）稀釋度均為1∶50， 4°C過夜，PBS沖洗2 min×3次，山羊抗小鼠IgG進行為期20 min的生物素化，用SABC進行20 min的滴加，最終使AEC顯色劑發(fā)生顯色。結(jié)果拍照留底。檢測心肌標(biāo)記：desmin、troponinI和troponinT。

1.2.4 RT-PCR檢測心肌特異性標(biāo)志物Nkx2.5 對照及誘導(dǎo)兩組細胞的總RNA用Trizol提取，cDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取，使用PCR儀進行35個循環(huán)的擴增。對正反引物及擴增產(chǎn)物長度進行統(tǒng)計，結(jié)果如下：β-actin 引物F：5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3’，R：5’-TACAGGTCTTTGCGG ATGTC-3’（400 bp），退火溫度61℃。Nkx2.5引物F：5’-GGA GAA GAC AGA GGC GGA CA-3’；R：5’-ACG CCG AAG TTC ACG AAG TT -3’（525 bp）。設(shè)定61℃為退火溫度。使用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物行質(zhì)量分數(shù)為1.0%的顯影，對結(jié)果進行拍照分析。

1.2.5 BrdU標(biāo)記誘導(dǎo)后細胞 人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)5aza誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)至28 d時，以含終濃度30 μmol/L BrdU的培養(yǎng)液進行更換并行24 h的再培養(yǎng)。移植前需將培養(yǎng)基倒掉，對細胞進行為期6次PBS清洗，加入2 mL的0.25%胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，而后棄上清液，重新兌入少量培養(yǎng)基，而后制成細胞總數(shù)下限為1×106個的細胞懸液100 μL。對照組注射相同體積的生理鹽水。

1.2.6急性心肌梗死模型的建立 取成年大鼠220～250 g，雌雄不限，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，四肢固定于鼠板，助手協(xié)助下暴露大鼠“魚嘴樣”喉口，持一柔韌鈍頭導(dǎo)絲，小心插入，再迅速將一中空質(zhì)軟塑料管沿導(dǎo)絲插入，過喉口有較大阻力，避免刺破氣管及血管，然后退出導(dǎo)絲，持一絲線檢查是否在氣管內(nèi)，確認后固定塑料管，防止術(shù)中脫落，正壓通氣80次/min。剪去左側(cè)胸部毛發(fā)，碘伏消毒，鋪無菌巾，于第四肋間處逐層分離皮膚、肌肉，開胸后用自制小拉鉤固定胸壁，打開心包，暴露心臟，輕微固定，持8-0無損傷縫線結(jié)扎左冠狀動脈回旋支終末1/3處，待局部心肌顏色變蒼白后，同時觀察心電圖的變化，出現(xiàn)ST段的抬高，迅速閉合胸腔。

1.2.7細胞移植 將胸腔關(guān)閉不少于40 min，成功造模，重復(fù)行胸腔開放以將心臟暴露，位于左冠脈前降支供血區(qū)可見其心肌組織呈蒼白態(tài)或顏色變淡狀態(tài)。以特制的注射器向發(fā)生缺血或梗死的心肌組織內(nèi)輸注0.1 mL含細胞數(shù)1×106細胞懸液，為防懸液外溢，推注速度宜放緩，同時為對照組注射等量生理鹽水，完成注射后即封閉胸腔、將切開的肌肉、皮膚予以縫合，最后將通氣插管拔除，觀察樣本的呼吸情況，若在5 min后并未出現(xiàn)呼吸急促、吸氣明顯三凹征等提示呼吸困難的指征，即將動物樣本轉(zhuǎn)入動物房行單籠隔離飼養(yǎng)，每日為手術(shù)創(chuàng)口行碘酒消毒，持續(xù)3 d。2周時取出心臟制作標(biāo)本。

1.2.8心肌細胞免疫熒光化學(xué)檢測 石蠟切片脫蠟置水，3%H2O2室溫孵育5～10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS漂洗3次，每次5 min；抗原修復(fù)。行10 min室溫下的10%正常山羊血清封閉及孵育。而后將稀釋為1∶100的一抗BrdU滴加到切片組織內(nèi)，在4℃環(huán)境下維持過夜。PBS漂洗3次，每次5 min；山羊抗兔IgG-FITC 室溫孵育，PBS振洗；0.25%Evans Blue 復(fù)染，PBS振洗；甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 人臍帶來源的MSCs的培養(yǎng)

人臍帶華爾通氏膠組織塊在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，5～7 d左右植塊邊緣可爬出形態(tài)相似于骨髓間充質(zhì)干細胞的成纖維樣細胞以小克隆狀態(tài)散在分布或形成，經(jīng)約2周即可達70%～80%的細胞融合，排列狀態(tài)呈平行或漩渦態(tài)。細胞傳代后形態(tài)呈梭形、平行或漩渦狀排列。3～5 d細胞增殖4～5倍，需再次傳代（圖1）。

2.2 行5aza誘導(dǎo)后的臍帶MSCs心肌細胞標(biāo)記的免疫化學(xué)檢查

行5aza誘導(dǎo)后的臍帶MSCs其desmin（圖2A）、troponinI（圖2B）、troponinT（圖2C）表達陽性：臍帶MSCs經(jīng)5aza誘導(dǎo)后心肌細胞標(biāo)記Nkx2.5和desmin檢測

2.3 采用RT-PCR檢測

Nkx2.5是心臟發(fā)育過程中早期的特殊的轉(zhuǎn)錄因子， Nkx2.5在心臟發(fā)育和保持出生后心臟穩(wěn)態(tài)，特別是心臟功能成熟以及工作心肌和心臟傳導(dǎo)的功能維持等方面起到非常重要的作用。誘導(dǎo)前Nkx2.5檢測陰性，5aza誘導(dǎo)后Nkx2.5檢測呈陽性，見圖3。

2.4 BrdU染色結(jié)果

實驗樣本切片清晰顯示，心肌樣細胞凡是行BrdU的誘導(dǎo)標(biāo)記后移植至心肌組織內(nèi)，經(jīng)2周后仍成功存活（圖4A），相比之下對照組呈陰性染色結(jié)果（圖4B）。

2.5熒光染色

在免疫熒光染色處置后的實驗樣本切片中，曾行熒光物標(biāo)記的移植細胞仍成功存活于心肌組織中（圖4C），對照組相比之下無可見任何曾行熒光標(biāo)記的細胞（圖4D）。

3討論

以往的觀念認為心肌細胞屬于不能進行再生的高分化永久性細胞。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，心肌梗死區(qū)域可有少量心肌細胞發(fā)生再生和增殖[6]，經(jīng)過進一步研究，人們認識到成熟的心肌在特定情況下可以進行自我更新。但是，這種心肌細胞的分化是很微弱的。目前認為，心肌組織本身的再生能力非常有限。因此，冠心病尤其是心肌梗死發(fā)生后，大面積心肌損傷可導(dǎo)致永久性心功能損害。Koh[7] 和Soonpaa[8]先后實驗證明干細胞移植至梗死心肌，可明顯改善心功能。Orlic等[9]于2001年提出干細胞移植能使心肌梗死中受損的心肌得到修復(fù)以來，干細胞移植就為冠心病的治療開辟了新的途徑。但無足夠來源供給移植細胞，且應(yīng)對免疫排斥反應(yīng)及道德倫理性輿論質(zhì)疑，故該療法全面普及應(yīng)用異常艱難。

MSCs擁有備受各界學(xué)者矚目的、卓越的多向分化潛能，截至目前，骨髓和臍帶血為其主要來源，但其在骨髓內(nèi)含量不理想，其在骨髓核細胞內(nèi)含量僅為1/105～1/104。本研究雖成功發(fā)現(xiàn)MSCs可存在于人體臍帶血內(nèi)，但傳代培養(yǎng)困難，難以獲得大量采集的條件[10，11]。

研究指出，臍帶間充質(zhì)細胞具有多能干細胞特點，故其分化潛能可達若干項，并擁有近似于骨髓源性 MSCs的形態(tài)及生物學(xué)特點[1-5]。臍帶 MSCs介于成體、胚胎兩種干細胞間，顯得更為原始，其胚胎干細胞分子表達標(biāo)志多樣，如Oct-4、Sox-2和Nanog等[12]，其在擁有更優(yōu)勢克隆形成率[13]的同時大大縮短了倍增時間[14，15]，故其擴增能力更為突出，擴增300倍僅需7代。本研究發(fā)現(xiàn)，在含EGF、FBS、bFGF的DMEM體外培養(yǎng)體系中，來源于人臍帶的MSCs增殖迅速，且第3代細胞和第8代細胞對MSCs相關(guān)的標(biāo)記物CD29、CD44、CD59可呈高表達體現(xiàn)，至于造血細胞表面標(biāo)記物CD14、CD33、CD34，以及關(guān)聯(lián)于移植排斥的細胞表面標(biāo)記物CD80、CD86、CD40則呈現(xiàn)不表達或低表達態(tài)勢。表明MSCs來源為人臍帶華爾通膠。該物質(zhì)特性與MSCs特性相同，同為免疫缺陷細胞，在不同個體間進行移植均有較好的適應(yīng)[16，17]。人臍帶組織間充質(zhì)干細胞來源廣、取材方便，富含細胞，故MSCs更易于從中獲取，且在培養(yǎng)與保存方面擁有便捷的特性，最重要的是從中采集的MSCs較好地保障了相對的免疫不成熟性，因此人臍帶組織間充質(zhì)干細胞可能會成為重要的細胞移植治療的臨床原料途徑。

間充質(zhì)干細胞分化方向之一為心肌細胞，自臍帶、骨髓及臍帶血內(nèi)提取的間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)后成功實現(xiàn)該方向的分化，臨床上群體報道成熟[18-20]。提示臍帶MSCs能成為治療損傷心肌的另一個重要的細胞來源。

綜合國內(nèi)外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的實驗方法，可以歸納為3種：第1種方法用5-氮雜胞苷誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞；第2種方法是將間充質(zhì)干細胞植入缺血的心肌組織，利用缺血心肌組織的微環(huán)境誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞；第3種方法是先用5-氮雜胞苷誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞，然后再植入缺血的心肌組織，繼續(xù)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞。作為胞嘧啶核苷類似物之一的5aza，其低甲基化作用可影響DNA中的部分胞嘧啶，在表型特異性基因的激活中有充分的參與。這些被甲基化的基因內(nèi)特定的肌源性決定部位其轉(zhuǎn)錄功能常失活，5aza誘導(dǎo)可實現(xiàn)去甲基化，成功激活轉(zhuǎn)錄功能，故而促使細胞分化為肌源性細胞[21]。

本研究采用第3種方法將人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)5aza誘導(dǎo)，經(jīng)免疫組化檢測，誘導(dǎo)后細胞表達心肌細胞標(biāo)記物desmin、troponinI、troponinT，RT-PCR檢測誘導(dǎo)后細胞表達心肌細胞特異性標(biāo)志物Nkx2.5；Nkx2.5是心臟發(fā)育過程中早期的特殊轉(zhuǎn)錄因子， Nkx2.5在心臟發(fā)育和保持出生后心臟穩(wěn)態(tài)，特別是心臟功能成熟以及工作心肌和心臟傳導(dǎo)的功能維持等方面起到非常重要的作用。誘導(dǎo)后細胞再用Brd-U標(biāo)記，在梗死實驗樣本心肌組織內(nèi)進行移植，在移植2周后清楚顯示這些間充質(zhì)干細胞仍存活。

人臍帶間充質(zhì)干細胞作為一種具有多能干細胞特點的細胞， 其應(yīng)用更為廣闊。①臍帶來源廣泛、收集便捷、不會損傷臍帶供給者，且不受法律及倫理制約的擔(dān)憂。②胎盤屏障始終保護臍帶，故臍帶組織難以被細菌或病毒感染。③臍帶較低的 MSCs 免疫源性決定其對HLA 配型不符有更大程度的耐受。④臍帶內(nèi)富含干細胞，保障了良好的擴增能力[22，23]。

綜上，將臍帶 MSCs成功開辟為全新的替代細胞來源路徑，其應(yīng)用于心肌梗死臨床領(lǐng)域的細胞移植治療前景異常廣闊。但是細胞移植的便捷路徑、最佳移植數(shù)目及時機、移植后分化、歸巢、評估在臨床上尚無成熟定論。同時，行移植后其心肌再生的機制或分化為心肌樣細胞、重建血循通道、旁分泌功能、促進內(nèi)源性干細胞等，具體機制的定位尚不明了，故間充質(zhì)干細胞在心梗細胞移植治療領(lǐng)域成熟的應(yīng)用流程還亟待探索與完善。

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（收稿日期：2013-02-22）