大鼠缺血再灌注損傷腎臟組織中褪黑素受體表達情況研究

[摘要] 目的 研究褪黑素受體（MR）在缺血再灌注損傷（I/R）大鼠腎臟組織中的表達情況及意義。 方法 24只健康雄性SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組和腎臟I/R組，每組8只。采用雙側(cè)腎蒂夾閉60 min后再灌注建立I/R腎臟損傷動物模型。術(shù)后24 h常規(guī)生化法檢測血肌酐、尿素氮的水平，HE染色觀察腎臟組織學(xué)改變。熒光定量PCR（RT-PCR）檢測腎臟組織中褪黑素受體MT含量。 結(jié)果 以U6為內(nèi)參基因，熒光定量PCR顯示正常情況下大鼠腎臟組織中MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術(shù)組顯著下降（P < 0.01）。 結(jié)論 MR在I/R損傷大鼠腎臟組織中的表達明顯下降，提示MR表達與腎臟應(yīng)激損傷相關(guān)，可能作為判斷腎臟I/R損傷程度的指標或治療的靶點。

[關(guān)鍵詞] 褪黑素受體；再灌注損傷；腎臟

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）20-0001-03

腎臟為高灌注器官，因而缺血再灌注損傷（I/R）在缺血性急性腎損傷的病理過程中起重要作用，是臨床常見的一個多因素、多途徑的復(fù)雜的病理過程[1]。然而，I/R的發(fā)生機制尚未完全闡明，目前認為氧自由基是I/R發(fā)病過程中的重要因素[2]。褪黑素（melatonin，MT）是松果腺分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有廣泛的生理作用，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等。研究證實，MT主要通過直接清除自由基和調(diào)節(jié)抗氧化酶發(fā)揮抗氧化作用[3，4]。褪黑素受體（MR）在人體器官組織中廣泛分布，褪黑素與其特異性膜受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究證實，應(yīng)激狀態(tài)時組織細胞中MR降低[5，6]。本實驗我們建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，通過研究MR在缺血再灌注損傷大鼠腎臟的表達水平，進一步闡明I/R的發(fā)生機制以及MR在I/R中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組

選取體重為250～280 g的SD大鼠24只，分為以下3組：①缺血再灌注組（n = 8）：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠（45 mg/kg體重），500 u肝素鈉腹腔注射，進腹后游離雙側(cè)腎臟，切除右腎，夾閉左腎動、靜脈45 min，然后開放，縫合腹壁。②假手術(shù)組（n = 8）：手術(shù)步驟與缺血再灌注組相同，但僅切除右腎，不夾閉左腎動、靜脈。③正常對照組（n = 8）：大鼠正常喂養(yǎng)，不做任何預(yù)處理。

1.2 主要儀器和試劑

Trizol試劑（美國GIBCO公司）；Taq DNA聚合酶（日本Takara公司）；10000×SYBR Green（美國Invitrogen公司）；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑（美國epicentre公司）；UniCalD×C800全自動生化儀（美國Beckman公司）；ABI PRISM 7900 實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；MTI、MT2受體引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供。

1.3 標本采集和處理

實驗大鼠分別于手術(shù)24 h后開腹經(jīng)腹腔靜脈采血，3 000 rpm/min離心15 min，取上清（血清）用于血肌酐和尿素氮水平檢測。處死各組大鼠，獲取腎臟組織。一部分在無RNA酶的研磨器內(nèi)加液氮反復(fù)研磨成粉狀，然后每50～100 mg組織樣品，加入1 mL的TRIZOL試劑，置于1.5 mL微量離心管并充分混勻，置于-80°C冰箱備用；另一部分用10%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.4 觀察指標

①腎功能檢測：采用日本Olympus公司Au2700型全自動生化分析儀檢測大鼠血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）濃度水平。②腎組織的病理學(xué)觀察：取各組大鼠同一部位腎臟組織常規(guī)制成石蠟標本，切片行HE染色，200倍光鏡下觀察腎間質(zhì)小管病變程度。

1.5 RT-PCR測定MT1和MT2表達水平

MR1、MR2受體引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供（引物序列見表1）。①總RNA的提取：采用Trizol法提取血清總RNA，異丙醇法濃縮RNA。NanoDrop ND-1000測定RNA濃度并評估純度，Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA分子完整性。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（按epicentre公司說明書規(guī)范操作）。③熒光定量PCR反應(yīng)：將試劑按說明書要求加入于反應(yīng)管中并置于PCR儀上。反應(yīng)條件如下：94℃ 1 min， 55℃ 1 min，72℃ 2 min延伸，40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線（每5秒升高1℃），實驗重復(fù)三次。④數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法（CT值定義為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）對MR1和MR2 表達進行分析。

表1 RT-PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)的組間差異的分析采用方差分析和t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清尿素氮及肌酐濃度水平比較

正常情況下，大鼠血清BUN和Cr濃度分別為（6.87±1.54） mmol/L和（24.17±4.29） μmol/L。缺血再灌注組大鼠血清BUN和Cr濃度分別為（34.73±7.95） mmol/L和（124.65±25.33） μmol/L，明顯高于正常組大鼠（P < 0.01）。假手術(shù)組大鼠血清BUN和Cr濃度略有升高，但和正常大鼠相比較差異不顯著（P > 0.05），見表 2。

2.2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化觀察

光鏡下缺血再灌注組大鼠腎臟可見近曲小管出現(xiàn)上皮細胞空泡變性、壞死和管腔擴張，其中可見管型和脫落細胞，間質(zhì)水腫。假手術(shù)組大鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細胞結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯損傷。采用Paller法對腎小管損傷程度評分：每高倍鏡視野隨機選擇10個腎小管計分，腎小管明顯擴張、細胞扁平1分；刷狀緣損傷1分，脫落2分；管型2分，腎小管管腔內(nèi)有脫落的、壞死的細胞（未成管型或細胞碎片）計1分。缺血再灌注組大鼠腎臟Paller評分結(jié)果明顯高于正常組和假手術(shù)組（P < 0.01），見表 2。

表2 各組大鼠腎功能水平和腎組織Paller評分（x±s）

注：★與正常組比較，t = 5.878，P < 0.01；▲與正常組比較，t = 13.469，P < 0.01；※與正常組比較，t = 10.074，P < 0.01

2.3 MR1和MR2各實驗組大鼠腎臟組織中的表達情況

以U6為內(nèi)參基因，熒光定量PCR顯示正常情況下大鼠腎臟組織中MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術(shù)組顯著下降（P < 0.01）（圖 1）。

圖1 各組大鼠腎組織MT1和MT2表達情況

3 討論

腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今仍未完全闡明。其病理過程主要為缺血階段和再灌注階段：缺血階段是指由于血流量下降而使腎組織缺血缺氧的狀態(tài)；再灌注階段則是使缺血的組織恢復(fù)血流的過程，但是再灌注的過程可以進一步加重缺血性組織的損傷。目前認為氧化應(yīng)激狀態(tài)是導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷的重要因素之一。其通過大量產(chǎn)生內(nèi)氧自由基（OFR）使脂質(zhì)過氧化破壞生物膜，而且還可以引起蛋白質(zhì)、核酸損傷而導(dǎo)致細胞死亡[7]。此外，缺血缺氧后引起細胞內(nèi)Ca2+的增加，形成Ca2+超載。腎小管上皮細胞和腎實質(zhì)細胞所產(chǎn)生的腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素1、6、8（IL-1、6、8）等炎性因子和活性氧族也會加重缺血再灌注損傷[8，9]。

目前研究發(fā)現(xiàn)褪黑素是一種作用很強的內(nèi)源性抗氧化劑，能夠直接清除和抑制氧自由基產(chǎn)生， 抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少氧自由基引起的Ca2+超載，還能增強內(nèi)源性抗氧化酶的作用。因此褪黑素對心、腦、肝等器官缺血再灌注損傷具有較強的保護作用[10，11]。褪黑素受體（MR）屬G 蛋白偶聯(lián)受體超家族（GPCRs）。G蛋白系統(tǒng)主要分為刺激性G蛋白（Gs）及抑制性G蛋白（Gi）系統(tǒng)。MR為膜受體， 通過特異性與褪黑素結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究證實，人體內(nèi)許多組織器官都有褪黑素受體表達，其中主要為MRI和MR2 兩種亞型[12]。研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)的改變或病理狀態(tài)下，人體褪黑素受體含量會隨之發(fā)生改變[13，14]。有研究顯示，在生理性狀態(tài)下，大鼠游泳前后體內(nèi)MT和MR的表達水平會發(fā)生改變，提示在應(yīng)激狀態(tài)下MT 升高的同時而MR 水平降低。王瑩等[15]報道缺血性腦損傷中，大鼠腎上腺組織MT 升高、MR 降低，給予外源性MT 可抑制缺氧缺血導(dǎo)致的過度應(yīng)激損傷，提示MT 和MR 在機體抗應(yīng)激過程中起一定作用。

本實驗研究結(jié)果顯示，正常情況下大鼠腎組織中褪黑素受體MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），缺血再灌注應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠腎組織中褪黑素受體表達水平明顯下調(diào)，I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術(shù)組顯著下降（P < 0.01）。假手術(shù)組大鼠腎臟組織中MR表達水平較正常略有下降，但是并不明顯。以上的研究數(shù)據(jù)提示，MR表達水平的下降與應(yīng)激狀態(tài)下腎臟組織損傷程度有關(guān)。即應(yīng)激導(dǎo)致的損傷程度越重，MR的表達水平越低。這與前面的文獻報道是一致的。

總之，我們的研究表明應(yīng)激器官組織中MR表達水平不僅可以反映應(yīng)激損傷程度，而且其水平變化程度也可能參與調(diào)控應(yīng)激過程。因此，進一步研究MR在腎臟I/R損傷中的作用及其機制，不僅能夠提高我們對MR與相關(guān)疾病關(guān)系的認識和診療水平，也將為臨床有效治療腎臟I/R損傷提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2013-01-04）