薯莨提取物體外抗人型支原體的作用

[摘要] 目的 從中藥薯莨中提取具有體外抗人型支原體作用的成分，并測定其最小抑菌濃度，為開發(fā)薯莨提供依據(jù)。 方法 采用超聲提取法醇提，D101大孔樹脂梯度洗脫的方法得到不同的洗脫流分，經(jīng)固體培養(yǎng)法初篩具有體外抑制人型支原體作用的流分，再經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法測定其MIC范圍和MIC50值。 結(jié)果 薯莨正丁醇部位經(jīng)D101大孔樹脂梯度洗脫，其中25%乙醇洗脫流分具有較好的體外抑制人型支原體的作用，其MIC范圍是（16/32～128） mg/mL，而MIC50為32 mg/mL。 結(jié)論 薯莨具有抗人型支原體作用的開發(fā)和研究價值。

[關(guān)鍵詞] 薯莨；人型支原體；最低抑菌濃度

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）26-0102-02

泌尿生殖道支原體感染是非淋菌性尿道炎（NGU）的重要病因之一。近年來，泌尿生殖道支原體感染受到普遍重視。但隨著臨床上日趨嚴(yán)重的抗菌藥物濫用，泌尿生殖道支原體耐藥性也不斷發(fā)生著變化。因此，從中草藥中尋找有效治療藥物越來越受到重視。薯莨（Dioscorea cirrhosa Lour.）是薯蕷科薯蕷屬的一種藤本植物，其藥用有效成份主要包括塊莖中的酚類、苷類等。本品味微苦、澀，性微寒，藥理作用包括活血止痛、止血止癢、解毒抗菌[1]、收縮子宮平滑肌[2]和治療應(yīng)激性潰瘍[3]等。目前國內(nèi)外對中藥薯莨的研究非常少，而有關(guān)其有效成份方面的研究則更少。近年來本課題組的研究表明，薯莨提取物具有降壓作用[4]。同時，薯莨浸膏對泌尿生殖道人型支原體（Mycoplasma hominism，MH）也有較強(qiáng)的抗菌作用，并找到薯莨抗泌尿道人型支原體作用的有效部位，為臨床上治療泌尿生殖道支原體感染篩選新藥和有效開發(fā)中草藥薯莨提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 A7固體培養(yǎng)基購自法國梅里埃生物公司。人型支原體液體培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[5]方法配制。1：1牛心消化液、10%新鮮酵母液、20% 新生小牛血清、0.002%酚紅、青霉素20 000 U/L。加0.1%精氨酸，pH調(diào)至6.5[6]。

1.1.2 支原體株 從泌尿生殖道感染患者的標(biāo)本中分離獲得30株人型支原體（MH）菌株，經(jīng)初步鑒定[5]，傳代3次后，保存于-70℃?zhèn)溆谩嶒灳海喝”４娴膫溆镁?，在室溫下融化，用人型支原體液體培養(yǎng)基按1：100稀釋，37℃培養(yǎng)24～48 h后達(dá)106顏色變化單位（color changing unit， CCU）/0.1 mL作為接種物[6]。

1.1.3 提取物的制備 ①原藥處理 取8.1 kg薯莨塊莖（采自湖南省平江縣，經(jīng)南華大學(xué)生藥學(xué)鑒定，標(biāo)本存放于南華大學(xué)藥物藥理研究所），洗凈，干燥，粉碎。在75%乙醇中浸泡4 h，超聲回流提取4次，得總浸膏1 612.5 g。取浸膏850.0 g（相當(dāng)于原藥材4 269.8 g），加水4 L，充分?jǐn)噭?，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取液減壓蒸餾濃縮，揮干，稱重，得石油醚部位13.17 g，乙酸乙酯部位247.05 g和正丁醇部位445.00 g。② D101大孔樹脂分離 活性跟蹤結(jié)果顯示正丁醇部位具有體外抗人型支原體的活性。取正丁醇萃取成份320.0 g（相當(dāng)于原藥材3 070.4 g）上D101大孔吸附樹脂柱（5.5×120 cm），依次用水和不同濃度（梯度為5%）的乙醇洗脫，每濃度洗6個柱體積（BV）。收集各濃度洗脫流分，濃縮，揮干。5%、10%、15%、25%、30%、35%洗脫流分依次命名為A、B、C、D、E、F。稱重分別為24.61 g、18.14 g、12.10 g、24.75 g、12.48 g、6.20 g。

1.2實驗方法

1.2.1 初篩實驗 取相同重量各洗脫部位組分分別溶于1%二甲基亞砜（DMSO）溶液配成相同濃度（預(yù)實驗用1% 二甲基亞砜，沒有發(fā)現(xiàn)有抗人型支原體的作用）。取A7固體培養(yǎng)基，37℃恒溫箱復(fù)溫10 min，將培養(yǎng)基均分為三個區(qū)，在不同區(qū)中央滴入同一洗脫部位的1% DMSO溶液50 μL，倒置10 min，無菌接種環(huán)在藥液區(qū)內(nèi)均勻接種MH菌株，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選擇1% DMSO溶液作為陰性對照，0.1 g/mL阿奇霉素溶液作為陽性對照。培養(yǎng)96 h后，取出培養(yǎng)基，倒置，在10倍物鏡顯微鏡下，觀察視野中煎蛋樣菌落，順時針方向在三個區(qū)中各取5個視野，記錄菌落數(shù)[7]。根據(jù)A7固體培養(yǎng)基說明書，以平均每個視野中菌落數(shù)<15個作為有效洗脫部位的判斷依據(jù)。

1.2.2 提取物的預(yù)處理 根據(jù)初篩實驗結(jié)果，稱取有效洗脫部位流分適量，用1% DMSO 溶解，后用人型支原體培養(yǎng)基稀釋，應(yīng)用母液濃度為256 mg/mL。將應(yīng)用母液pH調(diào)至培養(yǎng)基pH一致。

1.2.3 體外最小抑菌濃度測定 ①菌落培養(yǎng)（液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法） 將經(jīng)過初篩實驗體外有效洗脫部位流分加入人型支原體液體培養(yǎng)瓶中。采用液體培養(yǎng)基稀釋法[8]，在96孔板上，向每一孔內(nèi)均加100 μL培養(yǎng)基。從第1～7孔將應(yīng)用母液倍比稀釋至（128～2） mg/mL。第八孔為空白對照。用支原體培養(yǎng)基按1：100稀釋MH培養(yǎng)物，混勻取100 μL加入每一個孔內(nèi)。將加好的96孔板蓋上板蓋，輕搖混勻，置于濕盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱孵育。每一濃度藥液均取50 μL加入A7固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96 h。② 結(jié)果觀察 觀察培養(yǎng)基的顏色變化，如果有支原體生長，培養(yǎng)基將由黃色變?yōu)榧t色。24～48 h內(nèi)觀察MH生長變化，如加藥孔與陰性對照孔顏色變化相同，則該濃度藥物對MH無抑制作用。如48 h后仍不出現(xiàn)顏色變化，則該濃度為能抑制MH生長的有效藥物濃度。其中無顏色變化的最小藥物濃度為有效抑制支原體生長的最小藥物濃度（MIC）。實驗采用MH標(biāo)準(zhǔn)株作參照。同時計算每一濃度藥液經(jīng)A7固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后9個視野中平均菌落數(shù)，以平均每個視野<15個菌落的最小濃度為最小抑菌濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 洗脫部位性狀

各洗脫部位中，A和B組分為深紅色粉末狀物質(zhì)，溶于水、甲醇、乙醇、二甲基亞砜等極性溶劑。C和D組分為深黃色粉末狀物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等，溶于溫水（>45℃）。E和F組分為黃色粉末狀物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等，溶于熱水（>70℃）。

2.2初篩實驗

各洗脫部位均配成0.2 g/mL濃度進(jìn)行初篩實驗。結(jié)果顯示，D組分具有明顯的體外抗人型支原體作用，見表1。

2.3最小抑菌濃度測定

經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果見表2，兩種培養(yǎng)法測定的最小抑菌濃度相近。

3討論

人型支原體是女性泌尿生殖道感染的常見病原之一，可引起盆腔炎、急性腎盂腎炎等多種生殖道疾病和創(chuàng)傷感染、支原體血癥等生殖道外感染[9]。因此，MH感染日漸為人們所重視，不斷有抗支原體新藥問世。

中藥薯莨為薯蕷科植物。其藥用有效化學(xué)成分包括皂苷類和生物堿等。既往研究證實，薯蕷科植物的總皂苷成分具有治療心血管疾病、平喘、抗炎和抗腫瘤等多種作用[10，11]。而其抗人型支原體作用卻未見報道。筆者在對薯莨有效成分的提取和分離的實驗中，發(fā)現(xiàn)薯莨正丁醇部位通過D101大孔樹脂梯度洗脫后，25%乙醇洗脫流分具有較好的體外抑制人型支原體的作用。經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法證實，其MIC范圍為（16/32～128） mg/mL，而MIC50為32 mg/mL。兩種培養(yǎng)方法有一定的偏差，主要是因為該流分有較深的顏色影響了結(jié)果的判斷。

臨床上人型支原體一般采用液體培養(yǎng)法，依據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化情況判斷支原體的存在與否，結(jié)果容易分辨，但缺點是容易污染及可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[12]。同時大部分的中藥提取液本身具有顏色，與培養(yǎng)液混合后，容易使結(jié)果的判斷產(chǎn)生偏差。A7固體培養(yǎng)基作為經(jīng)典的解脲和人型支原體分離的培養(yǎng)基，具有在低倍鏡下觀察菌落數(shù)既直觀又可靠的優(yōu)點[12]。由于本實驗中梯度洗脫的各流分均有較深的顏色，可以影響液體培養(yǎng)法中藥敏試驗結(jié)果的判斷。本實驗采用人型支原體直接劃線固體培養(yǎng)法對各流分先進(jìn)行初篩，再采用液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法測定有效流分的MIC范圍和MIC50，既解決了單純液體培養(yǎng)法中各流分顏色的影響，又可以解決單純的固體培養(yǎng)法中各流分的濃度難以精確稀釋的問題。

本實驗證實了中藥薯莨具有較好的抑制體外人型支原體的作用。25%乙醇洗脫流分是一個具有成千上萬個單體的混合物，導(dǎo)致最小抑菌濃度數(shù)值偏大。而且，其中的有效單體成分還需在接下來的提取和分離實驗中經(jīng)活性跟蹤的方法深入研究。但本實驗結(jié)果為開發(fā)中藥薯莨，深入研究其藥理作用，尋找新的具有抑制人型支原體作用的藥物提供了線索。

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（收稿日期：2013-05-29）