散發(fā)性結(jié)直腸癌中CpG島甲基化表型研究及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系

[摘要] 目的 研究散發(fā)性結(jié)直腸癌（SCRC）中CpG島甲基化表型（CIMP）陽性的發(fā)生率及其臨床病理特征，并探討其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）的關(guān)系。 方法 采用甲基化特異性PCR（MSP）方法對91例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者行P16、hMLH1、MINT1、MINT2和MINT31共5個(gè)基因啟動子甲基化檢測，分析散發(fā)性結(jié)直腸癌中CIMP陽性病例的臨床病理特征。同時(shí)應(yīng)用熒光標(biāo)記多重PCR法擴(kuò)增兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)BAT25和BAT26，分析兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)狀況，探討CIMP與MSI的關(guān)系。 結(jié)果 91例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中共檢出CIMP陽性者22例，陽性率為24.2%。CIMP陽性者與CIMP陰性者相比，前者好發(fā)于近端結(jié)腸（P=0.02）、分化程度上低分化癌多見（P=0.03）、組織學(xué)類型上黏液腺癌或印戒細(xì)胞多見（P=0.04）。27.3%的CIMP陽性病例表現(xiàn)為MSI，54.5%的MSI病例表現(xiàn)為CIMP陽性（P=0.02）。 結(jié)論 CIMP的散發(fā)性結(jié)直腸癌具有好發(fā)于近端結(jié)腸、低分化癌及黏液腺癌或印戒細(xì)胞多見等特點(diǎn)，CIMP與MSI兩者具有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 散發(fā)性結(jié)直腸癌；CpG島甲基化表型；微衛(wèi)星不穩(wěn)定

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）26-0051-03

近年來研究揭示DNA啟動子異常甲基化是抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活的重要機(jī)制，Toyota等[1]提出CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）的概念，用于反映多個(gè)抑癌基因的同時(shí)異常甲基化狀態(tài)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）是基因組遺傳不穩(wěn)定的一個(gè)重要標(biāo)記，在結(jié)直腸癌中MSI已成為篩查遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）的重要分子指標(biāo)[2]，但在散發(fā)性結(jié)腸癌中，有關(guān)CIMP與MSI關(guān)系的研究國內(nèi)外報(bào)道尚不一致[3，4]。本研究通過檢測與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的5個(gè)抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)，研究散發(fā)性結(jié)直腸癌中CIMP陽性的發(fā)生率及其臨床病理特征，同時(shí)探討CIMP與MSI的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集浙江省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科2009年1～6月份收治的手術(shù)切除91例結(jié)直腸腫瘤標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未行放療和化療，并有明確病理診斷，無腫瘤家族史。所有腫瘤標(biāo)本均于手術(shù)切除后15～30 min內(nèi)取材，并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱中保存。

1.2 DNA提取

采用酚/氯仿/異戊醇法提取基因組DNA。

1.3 MSP檢測

按文獻(xiàn)方法進(jìn)行DNA的亞硫酸鹽處理[5]，P16、hMLH1、MINT1、MINT2及MINT31 5個(gè)抑癌基因的MSP甲基化及非甲基化引物和反應(yīng)條件見表1。PCR反應(yīng)混合物包括：1×PCR buffer[16.6 mmol/L（NH4）2SO4，67 mmol/L Tris（pH 8.8）]，dNTP 0.4 mmol/L，MgCl2終濃度2.5 mmol/L，上下游引物各10 pmol，亞硫酸鹽處理后的模板DNA（30～50 ng），用ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。95℃預(yù)反應(yīng)5 min后加入熱啟動Taq酶（Hot-star Taq DNA多聚酶，Qiagen公司）0.75 U，之后94℃變性45 s，退火溫度45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。以SssⅠ處理過的DNA（New England Biolabs，Ipswich，MA）作為陽性對照，以蒸餾水為空白對照，PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外線凝膠掃描系統(tǒng)中觀察結(jié)果。MSP產(chǎn)物電泳時(shí)只出現(xiàn)未甲基化條帶時(shí)為未甲基化，如出現(xiàn)甲基化條帶則為甲基化。5個(gè)基因中有2個(gè)或2個(gè)以上基因同時(shí)出現(xiàn)甲基化條帶者，該樣本定義為CIMP陽性[4]。

1.4 MSI檢測

選用BAT25和BAT26兩個(gè)位點(diǎn)，PCR反應(yīng)后將反應(yīng)物在ABI PRISM 3730XL DNA測序儀上按儀器說明進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，數(shù)據(jù)由GenScan3.1軟件收集后進(jìn)行分析。如果腫瘤組織DNA出現(xiàn)正常組織DNA沒有的峰形判斷為MSI。本研究按參考文獻(xiàn)將BAT25、BAT26兩個(gè)位點(diǎn)均為陰性定義為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS），兩個(gè)位點(diǎn)均為陽性定義為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），單個(gè)位點(diǎn)陽性者定義為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件分析，比較CIMP陽性者與CIMP陰性者兩者的病理特征，并分析5個(gè)基因的甲基化及CIMP狀態(tài)與MSI的關(guān)系。采用χ2檢驗(yàn)與Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

91例SCRC中共檢出CIMP陽性者22例，陽性率為24.2%，5個(gè)基因的MSP產(chǎn)物電泳圖及甲基化狀態(tài)見圖1及表2。CIMP狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系見表3，CIMP陽性者與CIMP陰性者相比，前者好發(fā)于近端結(jié)腸（P < 0.05）、分化程度上低分化癌多見（P < 0.05）、組織學(xué)類型上黏液腺癌或印戒細(xì)胞多見（P < 0.05）。27.3%的CIMP陽性病例表現(xiàn)為MSI，54.5%的MSI病例表現(xiàn)為CIMP陽性，5個(gè)基因的甲基化狀態(tài)及CIMP與MSI的關(guān)系見表4，其中hMLH1甲基化及CIMP狀態(tài)與MSI密切相關(guān)（P < 0.05或P < 0.01）。

3 討論

近年來研究顯示CIMP陽性的SCRC具有獨(dú)特的病理特征，Toyota等[1]研究顯示近端結(jié)腸癌中82%病例存在CIMP陽性，而遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌只有37%，兩者存在顯著差異。Lee等[6]結(jié)果表明CIMP陽性的SCRC多位于近端結(jié)腸（24/42），明顯高于CIMP陰性的病例（30/92，P=0.007），本研究結(jié)果也顯示CIMP陽性的SCRC多位于近端結(jié)腸，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究還顯示CIMP與腫瘤的分化程度以及病理類型有密切關(guān)系，CIMP陽性的SCRC低分化癌更為多見，目前多數(shù)文獻(xiàn)顯示CIMP陽性的SCRC與低分化腫瘤有關(guān)[6]，但也有研究未發(fā)現(xiàn)CIMP狀態(tài)與腫瘤分化程度有關(guān)[7]，有關(guān)CIMP與腫瘤分化程度的機(jī)制目前尚不明確。關(guān)于CIMP和腫瘤分期的關(guān)系，目前文獻(xiàn)報(bào)道亦不一致。Shannon等[8]研究發(fā)現(xiàn)CIMP陽性的SCRC分期較晚，但也有部分研究未發(fā)現(xiàn)CIMP與結(jié)直腸癌分期相關(guān)[9，10]，本研究中未發(fā)現(xiàn)CIMP狀態(tài)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。

SCRC中CIMP陽性與MSI-H的病例具有相似的臨床病理特征如多位于近端結(jié)腸和低分化癌多見等，本研究結(jié)果顯示27.3%的CIMP陽性病例表現(xiàn)為MSI，54.5%的MSI病例表現(xiàn)為CIMP陽性，提示CIMP陽性與MSI兩者間存在密切關(guān)系，與Lee等[10]的研究結(jié)果相似，近年來有研究顯示MSI-H病例的臨床病理特征取決于CIMP狀態(tài)[11]。本研究中CIMP 5個(gè)基因中hMLH1啟動子異常甲基化與MSI存在顯著關(guān)聯(lián)，所有hMLH1啟動子異常甲基化的SCRC均表現(xiàn)為MSI。SCRC中較少存在錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR）突變，但部分腫瘤存在hMLH1啟動子異常甲基化，提示hMLH1啟動子異常甲基化是SCRC中發(fā)生MSI的重要機(jī)制。另外有部分MSI-H的SCRC病例表現(xiàn)為CIMP陰性，或者盡管也表現(xiàn)為CIMP陽性，但hMLH1啟動子未檢測到異常甲基化，提示這部分患者的MSI發(fā)生還存在其他分子機(jī)制[12]，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-06-03）